Pdr5p跨膜螺旋6和7邊界位點(diǎn)突變引起Pdr5p功能受損的機(jī)制研究.pdf

1、微生物耐藥是抗菌治療中面臨的嚴(yán)峻挑戰(zhàn)之一。近年來，致病真菌的多藥物耐藥現(xiàn)象日益增多，導(dǎo)致免疫缺陷、器官移植等病人抗感染治療難度增大，治療費(fèi)用昂貴，臨床致死率較高。導(dǎo)致多藥物耐藥現(xiàn)象的一個(gè)重要原因是細(xì)胞中ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白過量表達(dá)。Pdr5p是釀酒酵母中重要的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，它與許多致病酵母菌株中發(fā)現(xiàn)的ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在結(jié)構(gòu)和功能上高度相似。以Pdr5p為模型，研究ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白介導(dǎo)的多藥物耐藥性分子機(jī)制已成為近年的研究熱點(diǎn)。
　　 本

2、論文采用PCR介導(dǎo)的隨機(jī)突變方法，對(duì)高表達(dá)質(zhì)粒YEplac195：BPDR5進(jìn)行突變，在氟康唑藥物板上篩選到兩個(gè)能導(dǎo)致Pdr5p外排泵功能嚴(yán)重受損的單一位點(diǎn)突變C793F和S1230F。其中C793位于預(yù)測(cè)的Pdr5p跨膜螺旋6(TMH6)的胞內(nèi)邊界上，而S1230位于跨膜螺旋7(TMH7)的胞外邊界處。通過研究兩個(gè)突變株的耐藥性，發(fā)現(xiàn)其在含有放線菌酮、羅丹明6G、紅四氮唑的固體藥物板上具有和PDR5缺失菌株相同的耐藥表型。在含有上述藥

3、物不同濃度的液體培養(yǎng)基中，通過測(cè)定相對(duì)生長率，發(fā)現(xiàn)C793F和S1230F突變株對(duì)藥物的外排能力也顯著下降。Pdr5p特異性ATP酶活性實(shí)驗(yàn)和Western blot實(shí)驗(yàn)表明793和1230的突變沒有導(dǎo)致Pdr5p特異性ATP酶活性改變，突變的Pdr5p依然能夠正確定位在細(xì)胞膜上且蛋白表達(dá)量基本沒有受到影響，說明這兩個(gè)位點(diǎn)突變?cè)斐蒔dr5p功能受損的原因是氨基酸的差異性。
　　 為了進(jìn)一步研究Pdr5p功能受損的機(jī)制，我們通過定

4、點(diǎn)突變分別構(gòu)建了C793S，C793M，C793Y，S1230A，S1230N，S1230Y等單一位點(diǎn)系列突變株。通過研究這些突變菌株的藥物敏感性、Pdr5p特異性ATP酶活以及蛋白定位、表達(dá)等，發(fā)現(xiàn)所有突變菌株均具有和WT菌株相似的的ATP酶活性和膜定位，但其藥物敏感性則與替代的氨基酸的性質(zhì)相關(guān)。實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明在793位點(diǎn)，氨基酸空間體積改變是導(dǎo)致Pdr5p功能受損的主要因素；在1230位點(diǎn)，氨基酸的空間體積和極性的變化共同影響Pdr