烏拉坦誘導(dǎo)小鼠肺癌變過(guò)程中l(wèi)ncRNA表達(dá)改變.pdf

1、背景與目的：
　　長(zhǎng)片段非編碼RNA(lncRNA)是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過(guò)200 nt的RNA分子，不具有編碼蛋白質(zhì)功能，但在基因表達(dá)調(diào)控方面發(fā)揮著十分重要的作用。大量的研究表明，lncRNA數(shù)量龐大，且調(diào)控的方式多種多樣，它通過(guò)與DNA、RNA、蛋白質(zhì)的相互作用，在生命活動(dòng)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中扮演著十分重要的角色。目前對(duì)lncRNA的致病機(jī)制還知之甚少，但大量臨床觀察和實(shí)驗(yàn)證據(jù)顯示，lncRNA可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控編碼蛋白基因的表

2、達(dá)，從而參與物種進(jìn)化、胚胎發(fā)育、干細(xì)胞的維持、細(xì)胞的增殖分化以及腫瘤的發(fā)生等多種重要的調(diào)控過(guò)程。肺癌的發(fā)病率和死亡率在世界許多國(guó)家均居各種惡性腫瘤的首位，嚴(yán)重危害人們的健康和生命。目前，肺癌的診斷主要通過(guò)傳統(tǒng)的痰細(xì)胞學(xué)、影像學(xué)等診斷技術(shù)，它們?cè)诜伟┑脑\斷方面缺乏特異性，與其它肺部疾病，如肺炎，肺結(jié)核等難以鑒別。因此發(fā)現(xiàn)新的、適用于高危人群篩查，具有較高特異性和靈敏性的診斷方法是提高肺癌患者生存率的重要途徑。隨著腫瘤分子生物學(xué)研究的發(fā)展，

3、使從分子水平上診斷肺癌成為可能?，F(xiàn)有的研究表明，lncRNA在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用，lncRNA的異常表達(dá)存在于很多腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，如研究發(fā)現(xiàn)MALAT-1在非小細(xì)胞肺癌中呈過(guò)表達(dá)、PCGEM1在前列腺癌細(xì)胞中過(guò)量表達(dá)等。然而，目前對(duì)于lncRNA是否參與了肺癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及其作用機(jī)制仍然不清楚。因此，探討肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中l(wèi)ncRNA的表達(dá)譜變化，發(fā)現(xiàn)可能的特異性肺癌相關(guān)lncRNA分子標(biāo)記物，對(duì)于肺癌的早期診斷具有

4、重要的意義?；趌ncRNA可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，本研究以烏拉坦誘導(dǎo)的BALB/c小鼠肺癌模型為基礎(chǔ)，研究肺癌發(fā)生發(fā)展過(guò)程中l(wèi)ncRNA表達(dá)改變的情況，發(fā)現(xiàn)可能的特異性肺癌相關(guān)lncRNA分子標(biāo)記物，為lncRNA參與化學(xué)致癌機(jī)制提供了一定實(shí)驗(yàn)證據(jù)。
　　方法：
　　1.建立小鼠肺癌模型以1000mg/kg的劑量在小鼠右下腹腔內(nèi)注射烏拉坦（溶于200μl PBS磷酸鹽緩沖液中），每周注射一次，連續(xù)四次；對(duì)照組每

5、只小鼠在右下腹腔內(nèi)注射100μl PBS磷酸鹽緩沖液，每周注射一次，連續(xù)四次。分批將烏拉坦染毒后3個(gè)月的小鼠和6個(gè)月的小鼠處死，取出肺組織及腫瘤組織。
　　2.組織的病理分析制作對(duì)照組肺組織及烏拉坦處理組的肺腫瘤的病理切片，HE染色后，顯微鏡下觀察組織病理改變情況。
　　3.表達(dá)譜芯片檢測(cè)采用Invitrogen公司的Mouse Non-coding RNA Microarray（包含10802個(gè)小鼠lncRNA分子，251

6、79個(gè)小鼠mRNA分子）分別對(duì)烏拉坦染毒后6個(gè)月的小鼠肺腫瘤組織、癌旁組織及對(duì)照組肺組織進(jìn)行基因表達(dá)譜分析。
　　4.差異表達(dá)譜的分析分析表達(dá)譜中差異表達(dá)的lncRNA基因，篩選出表達(dá)倍數(shù)大于5倍的lncRNA。
　　5. qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果取肺腫瘤組織與正常肺組織各三個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣，用qRT-PCR定量檢測(cè)lncRNA表達(dá)改變是否與芯片結(jié)果相一致。
　　6. qRT-PCR檢測(cè)lncRNA表達(dá)水平采用SYBR

7、 Green染料法分別對(duì)烏拉坦染毒后3個(gè)月及6個(gè)月的小鼠正常肺組織、肺腫瘤組織和癌旁組織進(jìn)行qRT-PCR定量檢測(cè)目的基因的表達(dá)水平。
　　7.統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)均以x±s表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3次。滿(mǎn)足正態(tài)分布且方差齊同的兩組間 lncRNA表達(dá)差異的比較，采用兩組獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，不滿(mǎn)足正態(tài)分布時(shí)采用非參數(shù)檢驗(yàn)。所有檢驗(yàn)均以雙側(cè)P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：

8、　　1.動(dòng)物模型結(jié)果對(duì)照組小鼠均沒(méi)有發(fā)現(xiàn)肺腫瘤，烏拉坦染毒后3個(gè)月的小鼠肺腫瘤的發(fā)生率為85％，每只小鼠平均腫瘤數(shù)為2.81±2.04，腫瘤的平均大小為0.68±0.20；烏拉坦染毒后6個(gè)月的小鼠肺腫瘤的發(fā)生率為100%，每只小鼠平均腫瘤數(shù)為6.00±2.07，腫瘤的平均大小為1.76±1.34。
　　2.組織病理切片結(jié)果對(duì)照組小鼠肺組織切片無(wú)明顯的增生性或腫瘤性病變，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺腫瘤具有一致的外觀形態(tài)，腫瘤組織切片可見(jiàn)腺癌結(jié)節(jié)，

9、均為腺癌。
　　3. lncRNA芯片表達(dá)譜結(jié)果在肺腫瘤組織中l(wèi)ncRNA均上調(diào)或下調(diào)表達(dá)倍數(shù)在5倍以上且三次生物學(xué)重復(fù) P<0.01的lncRNA有42個(gè)，其中上調(diào)表達(dá)的lncRNA有14個(gè)，下調(diào)表達(dá)的lncRNA有28個(gè)。
　　4. qRT-PCR驗(yàn)證芯片結(jié)果 qRT-PCR定量檢測(cè) AF498294、AK017233和AK017306的表達(dá)改變情況與芯片結(jié)果相一致。
　　5. qRT-PCR檢測(cè)lncRNA表達(dá)水

10、平結(jié)果烏拉坦染毒后3個(gè)月和6個(gè)月的小鼠肺腫瘤組織中AF498294均是上調(diào)表達(dá)的，AK017233和AK017306均是下調(diào)表達(dá)；烏拉坦染毒后6個(gè)月的小鼠腫瘤組織中的AF498294表達(dá)水平比烏拉坦染毒后3個(gè)月的小鼠腫瘤組織高；烏拉坦染毒后3個(gè)月和6個(gè)月的小鼠肺癌旁組織與對(duì)照組肺組織相比較，AF498294均是上調(diào)表達(dá)的。
　　結(jié)論：
　　1.經(jīng)腹腔注射烏拉坦，可誘導(dǎo)BALB/c小鼠肺組織發(fā)生癌變，為本研究的后續(xù)工作建立了小