二惡英致大鼠肺癌變過程中E2F-1-Rb通路相關(guān)基因的表達(dá)研究.pdf

1、研究背景及目的：二惡英(Dioxin)是一類氯代含氧三環(huán)芳烴類化合物的統(tǒng)稱，它是環(huán)境中一類毒性極強(qiáng)的污染物。二惡英的來源有多個途徑：城市生活垃圾、工業(yè)廢物、醫(yī)院廢棄物的焚燒；殺蟲劑、除草劑、防腐劑和油漆添加劑等一些工業(yè)生產(chǎn)中所產(chǎn)生的副產(chǎn)品；此外，紙漿漂白、森林火災(zāi)、火山爆發(fā)、汽車尾氣的排放、吸煙等都會產(chǎn)生二惡英。二惡英的接觸方式主要是職業(yè)接觸和日常生活接觸，從事殺蟲劑、除草劑、防腐劑和油漆添加劑生產(chǎn)、垃圾焚燒、紙漿漂白等職業(yè)人群在工作的

2、過程中可以接觸二惡英；日常生活中，一些動物性食品如家畜、家禽及其肉、蛋、奶，魚類等水產(chǎn)品易受到二惡英污染，二惡英通過食物鏈在人和動物體內(nèi)蓄積，沉積在脂肪組織或臟器中。二惡英對人體的毒性主要表現(xiàn)為生殖毒性、免疫毒性、皮膚毒性和致癌性。由于二惡英脂溶性高，半衰期長，不易分解排出，因此它對人類健康危害不容忽視。 2，3，7，8-四氯二苯并二惡英(2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD)是該類物

3、質(zhì)中致癌作用最強(qiáng)的一種，被認(rèn)為是世界上毒性最強(qiáng)的化合物，已被列為人類Ⅰ類致癌物。TCDD對人和動物的致癌性研究己成為當(dāng)前的一個熱點(diǎn)，眾多動物實(shí)驗和人群隊列研究證明TCDD可致肺、肝、軟組織、皮膚、甲狀腺等多器官組織發(fā)生腫瘤，其中肺癌是TCDD引起的一類最常見的腫瘤，但其致癌機(jī)理仍然不清楚。隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的研究進(jìn)展，人們越來越認(rèn)識到細(xì)胞周期調(diào)節(jié)失控在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用。在哺乳動物細(xì)胞周期中，G1/S期之間的調(diào)控點(diǎn)是細(xì)胞內(nèi)

4、外信號傳遞、細(xì)胞增殖調(diào)控的關(guān)鍵點(diǎn)，腫瘤的發(fā)生、發(fā)展常與該調(diào)控點(diǎn)調(diào)節(jié)異常密切相關(guān)。而由P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因組成的調(diào)控途徑(E2F-1/Rb通路)與G1/S調(diào)控點(diǎn)的關(guān)系最為密切。因此，我們假設(shè)：E2F-1/Rb通路相關(guān)基因的異?？赡軙⑴c二惡英致肺癌變的有關(guān)機(jī)理。本課題擬建立二惡英致大鼠肺癌動物模型，運(yùn)用熒光免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)手段檢測大鼠肺組織P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因的表達(dá)情況，探討這些

5、基因的異常表達(dá)在二惡英致大鼠肺癌發(fā)生發(fā)展過程中的作用。 方法：1.建立二惡英致大鼠肺癌動物模型。將40只初斷乳SD大鼠分為二惡英染毒組(20只)和對照組(20只)，雌雄各半，飼養(yǎng)觀察二周后開始染毒。將TCDD溶于DMSO配制成濃度為125ng/ml，按0.58ng/g.BW劑量對染毒組大鼠進(jìn)行腹腔注射，每周染毒一次，對照組予以等體積DMSO溶劑腹腔注射。染毒6個月，染毒組和對照組分別于第2個月、3個月、4.5個月、6個月各處死5

6、只大鼠，取其肺組織，一部分液氮凍存，一部分浸泡于10％中性甲醛，制成石蠟切片待用。 2.病理診斷：對石蠟切片進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察各組大鼠肺組織的病理變化。由病理學(xué)專家進(jìn)行病理診斷。 3.用免疫熒光組織化學(xué)技術(shù)檢測各組大鼠肺組織中P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因的蛋白表達(dá)情況。同時設(shè)陽性對照和陰性對照進(jìn)行結(jié)果分析。 4.用RT-PCR檢測大鼠肺組織中P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因

7、mRNA表達(dá)。 5.統(tǒng)計分析，用SPSSforwindows11.0軟件進(jìn)行方差分析和卡方檢驗。 結(jié)果：1.成功建立了二惡英致大鼠肺癌模型。病理檢查顯示染毒組20只大鼠中正常5例，增生5例，異型增生6例，肺癌4例(包括1例小細(xì)胞肺癌，1例透明細(xì)胞癌，2例腺癌)。正常對照組20例中18例正常，2例輕度增生。并根據(jù)病理結(jié)果將TCDD染毒大鼠分為正常、增生、異型增生、肺癌四個組。 2.熒光免疫組織化學(xué)及PT-PCR檢測

8、P16、CyclinD1、Rb和E2F-1基因的表達(dá)，結(jié)果顯示： 2.1與對照組相比，TCDD染毒組中P16的蛋白表達(dá)顯著降低，P＜0.05；在TCDD染毒組中，隨著病變程度加重，P16的表達(dá)水平存在下降趨勢。PT-PCR檢測結(jié)果與熒光免疫組化法檢測結(jié)果一致。 2.2與對照組相比，TCDD染毒組中CyclinD1的蛋白表達(dá)均升高，具有顯著性差異(P＜0.05)；在TCDD染毒組中，隨著病變程度加重，其表達(dá)水平逐漸升高，各

9、組間兩兩比較均有差異顯著性(均有P＜0.05)，PT-PCR檢測結(jié)果與熒光免疫組化法檢測結(jié)果一致。 2.3與對照組相比，TCDD染毒組中Rb的蛋白表達(dá)均降低，具有顯著性差異(P＜0.05)；在TCDD染毒組中，隨著病變程度加重，其表達(dá)水平逐漸降低，但在TCDD染毒大鼠正常組與增生組、增生組與異型增生組差異無顯著性(P＞0.05，P＞0.05)，它們與肺癌組相比差異均有顯著性意義(P＜0.05，P＜0.05，P＜0.05)。PT-

10、PCR檢測結(jié)果與熒光免疫組化法檢測結(jié)果一致。 2.4與對照組相比，TCDD染毒組中E2F-1的蛋白表達(dá)明顯升高，P＜0.05；在TCDD染毒組中，隨著病變程度加重，其表達(dá)水平逐漸升高，各組間兩兩比較均有差異顯著性(均有P＜0.05)，PT-PCR檢測結(jié)果與熒光免疫組化法檢測結(jié)果一致。 結(jié)論：1.大鼠長期暴露于二惡英，可導(dǎo)致肺癌發(fā)生，以腺癌為主。其癌變過程中可見肺組織增生、異型增生、癌等不同程度病變。表明二惡英(TCDD)