A20基因對H-,2-O-,2-誘導的平滑肌細胞增殖及分子機制探討和中藥大黃素干預研究.pdf

1、目的：血管平滑肌細胞增殖是動脈粥樣硬化（AS）及經皮冠狀動脈介入治療（PCI）術后再狹窄（RS）的重要原因，對增殖機制以及抑制其增殖的研究近年來一直是心血管領域的熱點。過氧化氫（H2O2）是一種體內氧自由基，屬于活性氧家族成員之一。新近的離體研究發(fā)現(xiàn)H2O2可以通過細胞內信號傳導途徑來影響細胞的增殖，分化和多種基因的轉錄。核因子（NF-κB）是對活性氧敏感的轉錄因子，對于促炎因子的表達起重要的作用?；钚匝跬ㄟ^氧化調節(jié)NF-κB使其活化，

2、活化的NF-κB進入細胞核，調節(jié)涉及炎癥，增殖的多個基因的轉錄。已有實驗證明以H2O2為主要代表的活性氧通過轉錄因子NF-κB信號通路激活誘導血管平滑肌細胞的增殖從而參與了AS和PCI術后再狹窄的發(fā)生發(fā)展。多種生長因子、細胞因子、粘附分子等參與其病理生理過程，單純抑制某種特定的因子并不能完全抑制病灶形成。因此，阻斷由H2O2損傷引起的平滑肌細胞增殖、分化、遷移、炎癥反應等最終共同的關鍵靶向轉錄因子NF-κB信號通路，探求內源性細胞保護措

3、施，成為有效防止血管增生性疾病的研究方向。 鋅指蛋白A20是一種泛素調節(jié)酶，通過泛素化和去泛素化負反饋調節(jié)NF-κB信號系統(tǒng)，近年研究表明鋅指蛋白A20抑制多種炎性細胞誘導NF-κB激活所引起的血管平滑肌細胞增殖，是非常重要的細胞內源性自我保護蛋白。對于A20抗氧化損傷方面的研究甚少，本研究旨在通過采用鋅指蛋白A20基因干擾和轉染技術對其表達進行調控，觀察其對H2O2誘導的人臍動脈血管平滑肌細胞HUASMc增殖和NF-κB、酪氨

4、酸蛋白激酶Syk、細胞周期蛋白D1 CyclinD1、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑P21表達及NF-κB下游炎癥因子TNF-α的影響，以探討鋅指蛋白A20在氧化還原方面對細胞的保護作用，為血管增生性疾病的防治尋求新的途徑。 方法： 1）設計并體外化學合成三條人A20的siRNA序列，通過A20mRNA及蛋白測定篩選出對人A20基因具有較高干擾效率的siRNA序列。將培養(yǎng)的HUASMc隨機分為六組：空白組（培養(yǎng)基培養(yǎng)，未給

5、與任何干預）；A20siRNA組（轉染A20siRNA24小時）；scramble siRNA組（轉染陰性對照scramble siRNA24小時）；H2O2組（100μmol/LH2O2持續(xù)刺激6小時）；A20siRNA+H2O2組（轉染A20siRNA24小時后100μmol/L H2O2持續(xù)刺激6小時）；scramble siRNA+H2O2組（轉染陰性對照scramble siRNA24小時后100μmol/L H2O2持續(xù)刺激

6、6小時）。應用四甲基偶氮唑藍（MTT）方法測定細胞增殖活性；流式細胞技術觀察血管平滑肌細胞細胞周期的變化；RT-PCR方法觀察A20mRNA表達變化；Western-blotting方法觀察A20、NF-κB p65、Syk、CyclinD1、P21蛋白含量表達。雙抗體夾心ELISA方法檢測上清液TNF-α表達水平； 2）pCAGGS-GFP/A20質粒菌保涂Amp抗性的平板后，過夜培養(yǎng)。挑單菌落于3ml Amp抗性的LB培養(yǎng)基

7、中37℃搖床中過夜培養(yǎng)，集菌后，進行小量質粒提取，并使用EcoRⅤ/SmaⅠ進行雙酶切鑒定，酶切產物1%瓊脂糖凝膠電泳。將鑒定好的質粒菌保進行無內毒素質粒的大量提取，將質粒DNA提取物按適當比例稀釋，并測定濃度。將培養(yǎng)的HUASMc隨機分為四組：空白組（為空白對照組，不加任何干預因素）；H2O2組（在培養(yǎng)基100μmol/L的H2O2作用6小時）；A20組（向HUASMc轉染含A20基因的質粒后培養(yǎng)24小時）；A20+H2O2組（先向H

8、UASMc轉染含A20基因的質粒，培養(yǎng)24小時后在培養(yǎng)基中加入100μmol/L的H2O2作用6小時）。應用四甲基偶氮嘩藍（MTT）方法測定細胞增殖活性；流式細胞技術觀察血管平滑肌細胞細胞周期的變化；Western-blotting方法觀察NF-κB p65、Syk、CyclinD1、 P21蛋白含量表達。雙抗體央心ELISA方法檢測培養(yǎng)液TNF-α表達水平； 3）體外培養(yǎng)HUASMc，以H2O2作為刺激因素，以不同濃度大黃素（

9、EMD）作為干預因素，采用MTT比色、BrdU摻入法測定細胞增殖；采用RT-PCR方法檢測A20mRNA表達水平；采用蛋白質印跡技術檢測A20、NF-κB蛋白表達的變化。 結果： 1）與對照組比較，轉染A20siRNA的HUASMc中A20mRNA及蛋白表達水平明顯降低，以siRNAc最顯著，干擾效率大約55%，MTT結果顯示H2O2可誘導HUASMc增殖，H2O2后A20干擾對平滑肌細胞增殖活性有協(xié)同作用。流式檢測結果

10、表明H2O2組S期、G2/M期構成百分比，增殖指數(shù)均較空白組明顯增加；與H2O2組比較，H2O2+A20干擾后，細胞S期構成比和增殖指數(shù)明顯升高。H2O2刺激后A20mRNA與A20蛋白、NF-κB p65、Syk、cyclinD蛋白表達增加； P21蛋白表達量降低。A20干擾后使H2O2引起的上述變化趨勢更加顯著。雙抗體夾心ELISA結果示培養(yǎng)的細胞液中A20干擾后增加了H2O2所誘導的NF-κB p65下游的細胞炎癥因子TNF-α表

11、達水平； 2）將提取的重組真核表達質粒pCAGGS-GFP/A20使用EcoRⅤ/SmaⅠ進行雙酶切鑒定，酶切產物1%瓊脂糖凝膠電泳，質粒大小及酶切結果正確。轉染含A20基因質粒的HUASMc MTT細胞增殖活性降低，阻止細胞由G0/G1期進入S期，有效抑制H2O2刺激的HUASMc增殖。明顯抑制H2O2所誘導的NF-κB p65、Syk、CyclinD、TNF-α蛋白表達的增高。顯著逆轉H2O2引起的P21蛋白含量的下調；

12、 3）在10～80μmol·L-1范圍內，隨EMD濃度加大，MTTOD值及BrdU摻入OD值均逐漸變小，對H2O2誘導的HUASMc增殖具有抑制作用，且呈劑量依賴性。同時可呈劑量依賴性使HUASMc中A20mRNA和蛋白表達增加，NF-κBp65蛋白表達減少。 結論： 1）H2O2可誘導體外培養(yǎng)的HUASMc增殖及炎癥反應，激活Syk/NF-κB信號通路，上調Syk、NF-κB p65、CyclinD1的表達，下調P

13、21表達，促進炎癥因子TNF-α的產生； 2）A20siRNA干擾可以抑制HUASMc內源性A20mRNA和蛋白表達，具RNAi作用； 3）A20干擾可減弱內源性A20對H2O2/Syk/NF-κB p65信號通路的負反饋抑制作用，上調Syk、NF-κB p65、CyclinD1表達，下調P21表達，增加炎癥因子TNF-α表達，增強H2O2刺激引起的HUASMc增殖活性及炎癥反應； 4）A20基因轉染可上調細胞內

14、A20的表達，增強對H2O2/Syk/NF-κB p65信號通路負反饋抑制作用，下調CyclinD1表達，上調P21表達，改善細胞周期蛋白/細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑的平衡關系，減少炎癥因子TNF-α產生，從而達到抑制氧化應激損傷所引起的VSMC增殖及炎癥反應； 5）干預A20可能成為防治動脈粥樣硬化的新靶點，上調A20可能成為防治動脈粥樣硬化性疾病的新方法； 6）EMD對H2O2誘導的HUASMc增殖具有抑制作用，其