鼠婦對OPN誘導(dǎo)的血管平滑肌細胞增殖和遷移的影響及其分子機制研究.pdf

1、目的:血管平滑肌細胞(Vascularsmoothmusclecells，VSMC)的表型轉(zhuǎn)化、黏附、向內(nèi)膜下的遷移、增殖、分泌細胞外基質(zhì)（Extracellularmatrix，ECM）是高血壓、動脈粥樣硬化和血管成形術(shù)后再狹窄（Percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA）等血管重塑性疾病的細胞病理學(xué)基礎(chǔ)。其中，VSMC黏附、向內(nèi)膜下的遷移及增殖，參與血管的炎性增生，導(dǎo)致血管重塑，

2、這一過程依賴于細胞與ECM之間相互作用的細微動態(tài)平衡。研究表明，多種生長因子和ECM成分如:骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、纖連蛋白(FN)等均參與VSMC黏附、增殖與遷移的調(diào)節(jié)過程。其中ECM與整合素(integrin)相互作用所產(chǎn)生的效應(yīng)主要是通過其β亞單位胞內(nèi)區(qū)募集的蛋白激酶來調(diào)節(jié)肌球蛋白磷酸化狀態(tài)，細胞骨架重組和細胞遷移過程。
　　 整合素是由α和β亞單位組成的異源二聚體跨膜受體，VSMC主要表達整合素αvβ

3、3，它的主要配體包括OPN、FN和玻連蛋白（VN）等。由于整合素本身不具有激酶活性，它需要通過β亞單位的胞內(nèi)區(qū)與paxillin、talin、黏著斑激酶(Focaladhesionkinase，F(xiàn)AK)和整合素連接激酶(Integrin-linkedkinase，ILK)等相互作用，使其募集到胞膜內(nèi)側(cè)，共同形成黏著斑(focaladhesion)復(fù)合物，并啟動多條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，從而導(dǎo)致細胞骨架重組，引起VSMC的黏附和遷移，參與血管的炎

4、性增生和血管重塑過程。我們在前期的實驗中發(fā)現(xiàn)OPN可以誘導(dǎo)血管平滑肌細胞的黏附和遷移過程，并且FAK和ILK在這一過程中發(fā)揮重要作用。
　　 鼠婦（ArmadillidiumVulgare）又名鼠負、負蟠、鼠姑、鼠黏、地虱等，是甲殼綱等足目潮蟲科鼠婦屬動物的俗稱?！侗静菥V目》記載鼠婦具有破血、平喘、通經(jīng)、利尿、解毒、止痛等功效?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，鼠婦有抗小鼠心律失常、鎮(zhèn)痛、抗炎的作用，目前臨床應(yīng)用鼠婦可以治療痔瘡、尋常疣、中重度癌痛

5、、口腔炎、扁桃體炎、慢性氣管炎、手術(shù)后疼痛、肝癌等等。
　　 在多種血管重塑性疾病中，血管炎性增生明顯，導(dǎo)致管腔狹窄，是造成缺血性心臟病的重要原因，而鼠婦具有抗炎的重要功效。有研究表明是鼠婦通過抑制環(huán)氧化物酶(Epoxidehydrolase，COX)起到抗炎作用，進而參與血管重塑性疾病的發(fā)生和發(fā)展過程。但其是否影響血管炎性增生過程中血管平滑肌細胞的增殖和遷移過程尚未見相關(guān)報道。本研究觀察鼠婦對于OPN誘導(dǎo)的VSMC的遷移、增殖

6、、凋亡的影響，以及其相關(guān)的信號分子蛋白(FAK和ILK)表達活性的改變，來探討鼠婦在影響VSMC增殖和遷移方面的作用，并研究其相關(guān)的分子機制，為預(yù)防和治療以VSMC增殖和遷移為細胞病理學(xué)基礎(chǔ)的血管炎性增生性疾病（如動脈粥樣硬化、PTCA后再狹窄等）提供合理的實驗依據(jù)，奠定理論基礎(chǔ)，并提供新的治療靶點。
　　 方法:
　　 1.細胞培養(yǎng)
　　 按常規(guī)方法培養(yǎng)SD大鼠胸腹主動脈血管平滑肌細胞，選取3-5代細胞用于實驗

7、。
　　 2.流式細胞術(shù)檢測VSMC凋亡
　　 原代細胞培養(yǎng)至3-5代后，細胞分為7組，每組3-5瓶，分為對照組;不同濃度鼠婦水提取物組（W組），分別為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml;不同濃度鼠婦乙酸乙酯提取物組（E組），分別為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml;繼續(xù)37℃孵育24小時，收集各組細胞，PBS清洗2次，常溫離心機離心2000轉(zhuǎn)/分鐘，8分鐘，棄上清，加入70％乙醇固定，振蕩器混

8、勻后，4℃冰箱保存，1周內(nèi)送省四院實驗中心進行流式細胞術(shù)檢測晚期細胞凋亡。
　　 3.MTT法分別測定鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對基礎(chǔ)培養(yǎng)和OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 3.1.收集對數(shù)期細胞，調(diào)整細胞懸液濃度至5X104個/ml，接種于96孔板，200ul/孔，5％CO2，37℃孵育24小時。
　　 3.2.24小時后棄去培養(yǎng)液，加入無血清DMEM培養(yǎng)液，每孔200ul，分組如下，測定鼠婦對基礎(chǔ)培養(yǎng)V

9、SMC增殖影響時分為空白組、對照組、不同濃度的鼠婦W組（即0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml組）和不同濃度鼠婦E組（即0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml組）;測定鼠婦對OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖影響時分為空白組、對照組、OPN組，不同濃度的鼠婦水提取物+OPN組（濃度分為0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml組）和不同濃度鼠婦乙酸乙酯提取物+OPN組（濃度分為0.25mg/ml、0.5mg/ml、1mg/m

10、l組），每組重復(fù)3-5孔，37℃孵育24小時。
　　 3.3.每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5％MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h。
　　 3.4.棄去上清，終止培養(yǎng)。
　　 3.5.每孔加入150ul二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶聯(lián)免疫檢測儀，490nm測量各孔的吸光度值。
　　 3.6.分析實驗結(jié)果，觀察鼠婦對VSMC增殖的影響，并確定鼠婦的最佳有效濃度。

11、>　　 4.傷口愈合實驗測定細胞遷移
　　 VSMC培養(yǎng)至3-5代后，接種于6孔板中的消毒玻片上，分4組，分別為對照組，OPN組(20ug/ml)，鼠婦W組(0.5mg/ml)和鼠婦E組(1mg/ml)，細胞生長至100％匯合后，取出玻片，用無菌吸頭在玻片上劃痕。PBS洗凈被刮下的細胞后，將玻片置于各組培養(yǎng)液中，繼續(xù)孵育24h后取出，于低倍鏡下觀察細胞傷口愈合情況，任意取3個視野，計數(shù)遷移細胞的數(shù)量，以此表示細胞的遷移活性。<

12、br>　　 5.Westernbolt檢測增殖細胞核抗原(PCNA)、FAK、ILK蛋白表達水平收集各組VSMC→PBS洗滌→使用RIPA裂解液提取細胞總蛋白→蛋白定量→SDS-PAGE電泳→PVDF膜轉(zhuǎn)移→5％脫脂奶粉封閉，37℃1-2h→與一抗共孵育，4℃過夜→TTBS洗三次，10分鐘/次→與兔抗鼠IgG共孵育，37℃1-2h→TTBS洗三次，10分鐘/次，TBS洗一次，5分鐘/次→化學(xué)發(fā)光法顯影，用凝膠圖像分析系統(tǒng)記錄并測定各蛋

13、白條帶的積分光密度，以與β-actin的比值計算目的蛋白表達水平。
　　 6.統(tǒng)計學(xué)處理
　　 實驗數(shù)據(jù)用(X)±s表示，采用SPSS18.0統(tǒng)計分析軟件進行組間及組內(nèi)方差分析。Excel軟件作圖。各組檢驗均以P＜0.05為有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1.細胞凋亡檢測
　　 使用流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡，結(jié)果表明，對照組及各濃度鼠婦W組、鼠婦E組之間細胞凋亡差別不大，無明顯統(tǒng)計學(xué)意義，說明實

14、驗濃度范圍內(nèi)鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物不影響VSMC的凋亡過程。
　　 2.MTT法測定細胞增殖
　　 2.1.鼠婦水提取物對基礎(chǔ)培養(yǎng)VSMC增殖的影響
　　 MTT法實驗結(jié)果表明，各濃度的鼠婦W組不影響基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下的VSMC增殖活性，各實驗組與對照組間吸光度值無明顯差異，無統(tǒng)計學(xué)意義，同時也說明此濃度范圍內(nèi)的鼠婦水提取物對VSMC無細胞毒性。
　　 2.2.鼠婦乙酸乙酯提取物對基礎(chǔ)培養(yǎng)VSMC增殖的

15、影響
　　 與2.1結(jié)果相似，各濃度鼠婦E組對于基礎(chǔ)培養(yǎng)條件下的VSMC增殖也無明顯作用，無統(tǒng)計學(xué)意義上的差別，同時也說明對細胞無毒性作用。
　　 2.3.鼠婦水提取物對OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 實驗結(jié)果表明，鼠婦水提取物對于OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖起抑制作用，但隨著鼠婦水提取物的濃度的增加，抑制作用減弱。統(tǒng)計分析表明，鼠婦W組（0.5mg/ml和1mg/ml）吸光度值分別為OPN組的85.5％和90

16、.9％，兩者與OPN組之間均有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05，說明低濃度鼠婦水提取物有抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的作用。
　　 2.4.鼠婦乙酸乙酯提取物對OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖的影響
　　 MTT法結(jié)果顯示，鼠婦乙酸乙酯提取物對于OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖也起抑制作用，且該抑制作用隨著鼠婦濃度的增加而增強，呈劑量依賴性。當(dāng)鼠婦E組濃度為1mg/ml時，其吸光度值為0.22667，是OPN組的81.6％，兩者之間有統(tǒng)計學(xué)差異

17、，P＜0.05。比較鼠婦W組（0.Smg/ml）與E組(1mg/ml)對細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)兩者之間差別不大，無統(tǒng)計學(xué)意義，說明兩者都可以抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖，無優(yōu)劣之分。
　　 3.傷口愈合實驗測定細胞遷移
　　 實驗結(jié)果表明，劃痕24h后對照組VSMC向中間遷移的較少，而給予OPN刺激后，大量VSMC從傷口兩側(cè)向中間遷移，使傷口面積大大縮小;而給予0.5mg/ml的鼠婦水提取物后，細胞的遷移能力受到明顯抑制，

18、遷移的細胞數(shù)下降為OPN組的76.7％;同樣的，給予1mg/ml的鼠婦乙酸乙酯提取物也可以抑制OPN誘導(dǎo)的細胞遷移，遷移的細胞數(shù)為OPN組的69.3％，其作用大于鼠婦W組。這說明鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物均可抑制OPN誘導(dǎo)的細胞遷移，且1mg/ml的鼠婦乙酸乙酯提取物效果更明顯。
　　 4.Westernbolt檢測PCNA、FAK、ILK蛋白表達水平
　　 4.1.Westernbolt檢測PCNA蛋白表達水平

19、>　　 WB結(jié)果表明，對照組PCNA蛋白表達水平比較低，給予OPN刺激后，其蛋白含量明顯增加，為對照組的1.59倍，但給予鼠婦后PCNA的表達下降，即OPN+各濃度鼠婦W組及OPN+各濃度鼠婦E組均可降低PCNA的表達水平，兩者的劑量依賴趨勢與MTT法結(jié)果一致，其中0.5mg/ml的鼠婦W組和1mg/ml的鼠婦E組抑制作用最明顯，分別為OPN組的77.8％和74.1％。這進一步證明鼠婦的這兩種提取物可以抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖。<

20、br>　　 4.2.Westernbolt檢測ILK蛋白表達水平
　　 給予OPN刺激后，ILK的表達水平明顯增加，這與我們前期的實驗結(jié)果是一致的。在OPN+鼠婦W組實驗中，我們觀察到隨著鼠婦濃度的增加，ILK的表達水平是逐漸升高的，即低濃度(0.5mg/ml)的鼠婦W組抑制OPN誘導(dǎo)的ILK表達作用更明顯，是OPN組的81.4％;但是，在OPN+鼠婦E組實驗中，隨著鼠婦濃度的增加，ILK的表達水平?jīng)]有明顯的改變，這說明鼠婦水

21、提取物可以通過抑制ILK來影響OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移。
　　 4.3.Westernbolt檢測FAK蛋白表達水平
　　 實驗結(jié)果顯示，OPN可以顯著的誘導(dǎo)FAK表達，這也與我們前期的實驗結(jié)果一致。在OPN+鼠婦W組實驗中，低濃度(0.5mg/ml)的鼠婦W組抑制OPN誘導(dǎo)的FAK表達作用更明顯，是OPN組的89.1％;而在OPN+鼠婦E組實驗中，高濃度（1mg/ml）的E組作用更明顯，為OPN組的82.2％。這

22、說明鼠婦的水提取物既可以影響FAK途徑也可以影響ILK途徑，而鼠婦乙酸乙酯提取物主要通過調(diào)節(jié)FAK途徑來影響OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖和遷移過程。
　　 結(jié)論:
　　 1.實驗濃度范圍內(nèi)的鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物不影響VSMC的凋亡過程，對VSMC無細胞毒性。
　　 2.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物不影響基礎(chǔ)培養(yǎng)下的VSMC增殖。
　　 3.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物均可抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC增殖。

23、
　　 4.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物均可抑制OPN誘導(dǎo)的VSMC遷移。
　　 5.鼠婦的兩種提取物均可以抑制OPN誘導(dǎo)的PCNA表達的增加。
　　 6.鼠婦水提取物可以抑制OPN誘導(dǎo)的ILK表達的增加，而乙酸乙酯提取物無該作用。
　　 7.鼠婦水提取物和乙酸乙酯提取物對于OPN誘導(dǎo)的FAK表達增加均有抑制作用。
　　 8.鼠婦乙酸乙酯提取物通過FAK途徑，而鼠婦水提取物通過FAK和ILK兩條途