H-,2-O-,2-對(duì)仔豬支持細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究.pdf

1、Sertoli細(xì)胞在精子生成過程中具有十分重要的作用，其數(shù)量對(duì)于成年動(dòng)物的精子生成量具有決定性意義，而且所有針對(duì)睪丸的毒物均將Sertoli細(xì)胞作為第一個(gè)作用對(duì)象。大量的研究表明，許多針對(duì)睪丸的藥物其作用與氧化應(yīng)激有密切關(guān)系。本研究以培養(yǎng)的仔豬睪丸支持細(xì)胞為研究對(duì)象，利用H2O2模擬機(jī)體的氧化應(yīng)激條件，研究了H2O2對(duì)Sertoli細(xì)胞凋亡的影響及可能機(jī)制，通過本研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)精子生成過程中微環(huán)境穩(wěn)定的調(diào)節(jié)機(jī)制，人工調(diào)控精子的發(fā)生奠定

2、理論基礎(chǔ)；而且也有利于闡明各種氧化應(yīng)激引起Sertoli細(xì)胞受損,導(dǎo)致雄性不育疾病的發(fā)病機(jī)理，為治療這類疾病提供新的思路。 為了建立氧化應(yīng)激引起體外培養(yǎng)Sertoli細(xì)胞的凋亡模型，本實(shí)驗(yàn)首先研究了不同濃度的H2O2對(duì)細(xì)胞活性的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨H2O2濃度的增加，Sertoli細(xì)胞呈現(xiàn)萎縮狀，觸角減少，折光性變?nèi)?，?xì)胞的脂滴減少等明顯變化，細(xì)胞的成活率明顯下降。為了證明這一變化與H2O2作用的關(guān)系，本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了H2O2對(duì)Ser

3、toli細(xì)胞內(nèi)ROS水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著H2O2濃度不斷增大，Sertoli細(xì)胞的ROS水平也呈上升趨勢(shì)，通過DHE染色發(fā)現(xiàn)超氧陰離子的水平在0-800μmol/L H2O2組逐漸上升，進(jìn)一步證明了H2O2對(duì)細(xì)胞內(nèi)ROS的影響。 本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)H2O2處理不同時(shí)間，在0～24h內(nèi)，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，細(xì)胞活率呈下降趨勢(shì)，48h時(shí)細(xì)胞活率與24h相比無(wú)明顯變化。因此，在后面的實(shí)驗(yàn)中，H2O2作用濃度為600μmol/L H2O2

4、，作用時(shí)間為24h。 在研究H2O2對(duì)Sertoli細(xì)胞凋亡的影響時(shí)，光鏡下發(fā)現(xiàn)細(xì)胞間隙不規(guī)則，密度分布不均勻的，折光性弱,出現(xiàn)空泡樣變性，觸角減少；電鏡檢查發(fā)現(xiàn)細(xì)胞連接消失，細(xì)胞膜皺縮，線粒體腫脹，形成凋亡小體等，表現(xiàn)出明顯的凋亡特征。為了進(jìn)一步研究H2O2對(duì)Sertoli細(xì)胞凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了Caspase3活性的變化，發(fā)現(xiàn)高濃度H2O2使活化的Caspase3表達(dá)量顯著上升，這表明，H2O2通過Caspase3依賴

5、性途徑誘導(dǎo)了Sertoli細(xì)胞凋亡。 為了進(jìn)一步確定H2O2對(duì)Sertoli細(xì)胞凋亡的影響，本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了H2O2對(duì)Sertoli細(xì)胞分泌功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，H2O2使轉(zhuǎn)鐵蛋白表達(dá)量顯著下降，這也表明H2O2在誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的同時(shí)，也降低了細(xì)胞的分泌的功能。 為了研究H2O2誘導(dǎo)Sertoli細(xì)胞凋亡的機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)還檢測(cè)了H2O2對(duì)Sertoli細(xì)胞抗氧化能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)H2O2使多種抗氧化物質(zhì)如SOD、GSH、CA

6、T等水平顯著下降，因此，H2O2降低Sertoli細(xì)胞的抗氧化能力是引起細(xì)胞凋亡的重要原因。 由于大量的研究表明，ROS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡可能與MAPK有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)也檢測(cè)了H2O2作用后Sertoli細(xì)胞內(nèi)ERK1/2和P38的磷酸化的變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ERK1/2和P38都被不同程度的激活，說明ERK1/2和P38參與了H2O2誘導(dǎo)Sertoli細(xì)胞凋亡。 綜上所述，本實(shí)驗(yàn)可以得到如下結(jié)論： (1)隨著H2O2作用濃度的

7、升高，Sertoli細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著升高，細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力下降，細(xì)胞活力顯著下降，凋亡率顯著上升。 (2)H2O2使Sertoli細(xì)胞間隙不規(guī)則，密度分別不均，折光性減弱，呈現(xiàn)萎縮狀，觸角減少等結(jié)構(gòu)變化，以及出現(xiàn)凋亡小體，胞質(zhì)緊實(shí)，細(xì)胞器集中，核膜皺縮，特征的新月形核，線粒體腫脹，線粒體內(nèi)嵴模糊等超微結(jié)構(gòu)變化，同時(shí)降低了Sertoli細(xì)胞的分泌能力。 (3)H2O2通過Casepase3依賴性途徑誘導(dǎo)Sertoli細(xì)