循環(huán)牽張應(yīng)力對(duì)大鼠許旺細(xì)胞增殖與表達(dá)的影響.pdf

1、目的：通過(guò)體外構(gòu)建許旺細(xì)胞循環(huán)牽張力學(xué)模型，對(duì)體外培養(yǎng)的許旺細(xì)胞實(shí)施循環(huán)牽張應(yīng)力刺激模擬載體神經(jīng)的緩慢牽張，探索循環(huán)牽張應(yīng)變刺激對(duì)周圍神經(jīng)來(lái)源許旺細(xì)胞增殖以及mRNA表達(dá)的影響，從細(xì)胞生物力學(xué)以及分子生物學(xué)角度探討肢體延長(zhǎng)中的神經(jīng)生長(zhǎng)延長(zhǎng)機(jī)制。
　　方法：
　　1.體外平面循環(huán)牽張應(yīng)力加載模型的建立：將硅橡膠材料制作成0.1 cm厚的透明薄膜，結(jié)合硅橡膠材料的泊松比以及彈性模量，應(yīng)用三維有限元分析軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，模擬硅橡

2、膠受到牽張應(yīng)變后產(chǎn)生的形變；通過(guò)MTT方法比較細(xì)胞在硅橡膠和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)板上的生長(zhǎng)情況，并采取體外皮下包埋實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證硅橡膠材料是否具有生物學(xué)毒性。
　　2.許旺細(xì)胞的純化：分離新生6d的Wista大鼠雙側(cè)坐骨神經(jīng)，雙酶消化法分離許旺細(xì)胞，用S-100免疫細(xì)胞化學(xué)染色方法對(duì)許旺細(xì)胞進(jìn)行鑒定。將收集到的細(xì)胞分為3組，分別應(yīng)用冷噴注法、改良冷噴注法和酶消化法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行純化，純化后的細(xì)胞分別計(jì)算純度，流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞活性，并從細(xì)胞純度、細(xì)胞活

3、性、純化后所得細(xì)胞數(shù)量三個(gè)方面對(duì)許旺細(xì)胞的純化方法進(jìn)行評(píng)估，從而尋找最佳的許旺細(xì)胞純化方法。
　　3.循環(huán)牽張應(yīng)變刺激加載：體外培養(yǎng)6d齡大鼠許旺細(xì)胞并傳至P3代，按照刺激強(qiáng)度分為0、5％和10％形變組，利用ElectroForce3200力學(xué)試驗(yàn)儀搭載的BioDynamic生物反應(yīng)艙系統(tǒng)，以6h為固定時(shí)間點(diǎn)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行頻率為0.25Hz的周期性牽張應(yīng)力刺激。觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同應(yīng)力刺激下許旺細(xì)胞的增殖率，獲得許旺

4、細(xì)胞增殖的最佳應(yīng)力值，并分為無(wú)力學(xué)刺激組和力學(xué)刺激組2組。Trizol分別提取細(xì)胞mRNA，采用高通量技術(shù)分析實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組細(xì)胞基因表達(dá)譜差異，并采用聚類分析、GO分析等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析整理。
　　結(jié)果：
　　1.本課題組自制的硅橡膠細(xì)胞載體表面應(yīng)力分布均勻，有效應(yīng)變面積分布大，生物學(xué)相容性尚可，在BioDynamic細(xì)胞應(yīng)力加載系統(tǒng)的配合下，可滿足許旺細(xì)胞的牽張刺激的實(shí)驗(yàn)。
　　2.相比冷噴注法和差速酶消化兩種方法

5、而言，改良冷噴注法提純?cè)S旺細(xì)胞存在操作簡(jiǎn)便，獲得許旺細(xì)胞純度高、不影響細(xì)胞活性等優(yōu)點(diǎn)，缺點(diǎn)是對(duì)操作者實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)和經(jīng)驗(yàn)要求相對(duì)較高，初學(xué)者不易掌握，需在多次實(shí)踐中摸索掌握，但不失為一種可供參考的許旺細(xì)胞純化新方法，適合在本實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)使用。
　　3.在5％的應(yīng)變刺激下，許旺細(xì)胞的S期細(xì)胞比例和增殖指數(shù)(PI)相比無(wú)應(yīng)變刺激時(shí)有所升高，然而15％的應(yīng)變刺激下，兩指標(biāo)同時(shí)降低；光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)許旺細(xì)胞表現(xiàn)出明顯的形態(tài)學(xué)變化。比較實(shí)驗(yàn)組與