縫隙連接蛋白Cx37基因多態(tài)性位點(diǎn)篩選及其與急性心肌梗死易感性的關(guān)聯(lián)研究.pdf

1、研究背景和目的： 急性心肌梗死(AcuteMyocardialInfarction，AMI)是在冠狀動(dòng)脈病變的基礎(chǔ)上，發(fā)生冠狀動(dòng)脈急性閉塞，血流中斷或減少，引起嚴(yán)重而持久的缺血性心肌壞死。臨床表現(xiàn)呈突發(fā)性，劇烈而持久的胸骨后疼痛，特征性心電圖進(jìn)行性改變及血清心肌壞死標(biāo)記物(心肌酶、肌鈣蛋白和肌紅蛋白等)增高，可發(fā)生心律失常、心力衰竭、休克等合并癥，常危及生命，為冠心病的嚴(yán)重類型。AMI相關(guān)研究愈來愈受重視。不穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊

2、突然破裂導(dǎo)致血小板激活和血栓形成是AMI的主要病理基礎(chǔ)，脂質(zhì)蓄積、大量炎癥細(xì)胞浸潤、纖維帽變薄、膠原蛋白和平滑肌細(xì)胞損耗等均可促使動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成(atherothrombosis)，而白細(xì)胞募集至受損動(dòng)脈內(nèi)皮是動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的先決條件。AMI是個(gè)人遺傳背景、行為方式和各種環(huán)境因素相互作用所引起的復(fù)雜性狀遺傳性疾病，其發(fā)生發(fā)展過程包括4條各具特征但又相互作用的生物學(xué)路徑：脂蛋白代謝異常、內(nèi)皮完整性受損、炎癥和血栓形成，除血脂異

3、常、吸煙、糖尿病、高血壓、腹型肥胖、缺少運(yùn)動(dòng)、少食蔬菜水果和肉食過多、精神緊張和大量飲酒等危險(xiǎn)因素外，某些基因和蛋白也與AMI的發(fā)生發(fā)展相關(guān)，研究風(fēng)險(xiǎn)標(biāo)記基因結(jié)合傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素有助于進(jìn)行AMI患者危險(xiǎn)分層評(píng)估。有研究表明，縫隙連接蛋白37(Cx37)基因可能與心肌梗死的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)，但由于Cx37C1019T多態(tài)性在不同種族、人群和環(huán)境中存在差異，不同研究結(jié)論之間可出現(xiàn)相反結(jié)論或矛盾之處。 縫隙連接蛋白(connexins，Cx

4、)編碼的蛋白是縫隙連接成份之一，縫隙連接由大量的、為小分子量材料提供擴(kuò)散路徑的胞間通道構(gòu)成。 單核苷酸多態(tài)性(singlenucleotidepolymorphism，SNP)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的一種DNA序列多態(tài)性，是人類可遺傳的變異中最常見的一種，占所有已知多態(tài)性的90％以上，主要表現(xiàn)為單個(gè)核苷酸的轉(zhuǎn)換和顛換，為第三代DNA遺傳標(biāo)記，其在藥物或疾病易感性、表型差異、遺傳性疾病診斷以及個(gè)體化疾病預(yù)防等領(lǐng)

5、域具重要應(yīng)用價(jià)值。Cx37C1019T多態(tài)性可致C-末端尾部發(fā)生脯氨酸-絲氨酸替換(Pro319Ser)，表達(dá)Pro319CX37蛋白的細(xì)胞的粘附能力弱于表達(dá)Ser319CX37的細(xì)胞，表明T等位基因個(gè)體細(xì)胞粘附能力強(qiáng)于C等位基因個(gè)體，致單核細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化區(qū)域易于募集，促進(jìn)AMI早期脂質(zhì)條紋的形成，從而可能增加罹患AMI的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)此，我們對(duì)Cx37基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行篩選，探討Cx37多態(tài)性在健康人群和急性心肌梗死人群中的分布

6、，并對(duì)Cx37基因dbSNPrs1764391位點(diǎn)與急性心肌梗死的關(guān)系進(jìn)行研究，探討Cx37基因C1019T(rs1764391)基因型與血清心肌梗死標(biāo)記物變化的關(guān)系。 方法： 1.Cx37基因多態(tài)性位點(diǎn)篩選 提取23例健康人和20例急性心肌梗死患者外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，擴(kuò)增Cx37基因(3067bp)，另外設(shè)計(jì)7條Walking引物，最后拼接成全序列。用DNA測序法分析PCR產(chǎn)物，篩選急性心肌梗

7、死患者Cx37基因單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)，為進(jìn)一步研究Cx37SNPs與急性心肌梗死的關(guān)系提供依據(jù)。 2.Cx37基因C1019T多態(tài)性位點(diǎn)基因型在正常人群中的分布 提取147例健康人外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA，自行設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerasechainreation-restrictionfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)分析Cx37基因C10

8、19T多態(tài)性位點(diǎn)基因型，探討Cx37基因C1019T(rs1764391)位點(diǎn)在健康人群中的分布。 3.Cx37基因dbSNPrs1764391位點(diǎn)與急性心肌梗死的關(guān)系 提取136例急性心肌梗死患者外周血單個(gè)核細(xì)胞DNA，自行設(shè)計(jì)引物，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(polymerasechainreation-restrictjonfragmentlengthpolymorphism，PCR-RFLP)技術(shù)分析

9、Cx37基因C1019T多態(tài)性位點(diǎn)基因型，結(jié)合147例健康人Cx37基因C1019T(rs1764391)基因型分析結(jié)果，研究Cx37基因dbSNPrs1764391位點(diǎn)與急性心肌梗死的關(guān)系。 4.Cx37基因C1019T基因型與血清心肌梗死標(biāo)記物變化的關(guān)系 以分離膠真空管采集研究對(duì)象外周血，分離血清與血細(xì)胞，日立7170全自動(dòng)生化分析儀(日本)檢測血脂系列和心功能指標(biāo)，德靈DimensionRXL全自動(dòng)化學(xué)分析系統(tǒng)檢測

10、心肌肌鈣蛋白I(cTnI)。所有血清學(xué)項(xiàng)目均按試劑說明書設(shè)置分析參數(shù)，定標(biāo)通過后進(jìn)行質(zhì)控品分析，確保質(zhì)控值符合要求后檢測上述血清學(xué)指標(biāo)，研究Cx37基因C1019T基因型與血清心肌梗死標(biāo)記物的關(guān)系。 結(jié)果： 1.通過DNA測序分析，在Cx37基因共篩選出15個(gè)SNPs，頻率約為0.49％，其中rs1764391多態(tài)性在健康人和急性心肌梗死人群中存在顯著差異，4個(gè)SNPs為新發(fā)現(xiàn)的潛在多態(tài)性位點(diǎn)，其分別位于E2編碼區(qū)、3’

11、-UTR調(diào)控區(qū)和非編碼區(qū)。 2.廣東漢族健康人群Cx371019位點(diǎn)CC、TT和CT基因型分布分別為65.31％，6.12％和28.57％，其中男性的CC、TT和CT基因型頻率分別為64.05％、6.74％和29.21％，女性的CC、TT和CT基因型頻率分別為67.24％、5.17％和27.59％，x2檢驗(yàn)結(jié)果表明基因型觀察值與預(yù)期值之間無顯著差異(x2=2.139，0.1

12、傳平衡定律；男女間等位基因頻率分布差異無顯著意義(x2=0.245p=0.620)。廣東男性漢族人群Cx37C1019T等位基因頻率(％)與瑞士、瑞典、意大利、非籍美國人、歐籍美國人和日本人群存在顯著差異(p<0.05)(與日本人群比較顯著性較弱，p=0.044)，而與中國臺(tái)灣人群比較無顯著性差異(p>0.05)。 3.AMⅠ組T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組，假定CC型OR值為1.0時(shí)，則TT基因型OR為3.911，CT基因型OR

13、為2.057，結(jié)果表明T等位基因個(gè)體AMI患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于C等位基因個(gè)體，TT基因型和CT基因型個(gè)體罹患AMI風(fēng)險(xiǎn)高于CC基因型個(gè)體。在男性人群中病例組T等位基因頻率高于對(duì)照組，T等位基因個(gè)體患AMI風(fēng)險(xiǎn)是C等位基因2.060倍，TT和CT基因型AMI患病風(fēng)險(xiǎn)分別是CC基因型的3.314倍和2.090倍。在女性人群中T等位基因個(gè)體AMI患病風(fēng)險(xiǎn)是C等位基因個(gè)體2.455倍，假定CC基因型患AMI風(fēng)險(xiǎn)為1.0，則TT基因型OR為5.353

14、，而女性人群AMⅠ組和正常對(duì)照組間CT基因型分布無顯著差異。 4.AMⅠ組和對(duì)照組血清學(xué)指標(biāo)比較組間血清學(xué)指標(biāo)cTnI(心肌肌鈣蛋白I)、CK-MB(肌酸激酶同工酶MB)、HsCRP(超敏C-反應(yīng)蛋白)、CRP(C-反應(yīng)蛋白)和LDL-CH(低密度脂蛋白膽固醇)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，而TC(總膽固醇)、TG(甘油三酯)、HDL-CH(高密度脂蛋白膽固醇)、ApoAl(載脂蛋白Al)、ApoB(載脂蛋白B)和Lp(a)

15、[脂蛋白(a)]組間無顯著差異(p>0.05)。 結(jié)論： 1.采用小樣本對(duì)健康人群和急性心肌梗死患者進(jìn)行測序可有效篩選出候選SNP。初步證實(shí)急性心肌梗死與Cx37基因C1019T(rs1764391)多態(tài)性相關(guān)，為后續(xù)應(yīng)用SNPs遺傳標(biāo)記預(yù)測急性心肌梗死患病風(fēng)險(xiǎn)提供了依據(jù)。 2.不同國家和地區(qū)人群CX371019T多態(tài)性等位基因頻率分布存在差異，此差異可能與不同地區(qū)、不同種族人群具不同的CAD和MI發(fā)病率相關(guān)。明

16、確不同地區(qū)、不同種族人群Cx37C1019T多態(tài)性位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布特征可為研究Cx37C1019T多態(tài)性與CAD和MI的關(guān)系提供進(jìn)一步的依據(jù)。 3.Cx371019位點(diǎn)T等位基因攜帶者AMI患病風(fēng)險(xiǎn)顯著高于C等位基因個(gè)體，TT基因型個(gè)體罹患AMI風(fēng)險(xiǎn)高于CC基因型個(gè)體，Cx37基因C1019T多態(tài)性可能是廣東漢族人群AMI患病危險(xiǎn)因素之一。 4.血清LDL-CH水平在病例組和對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<

17、0.05)，且在不同基因型之間也存在差異(p<0.05)，TT和CT基因型LDL-CH水平顯著高于CC基因型(p分別為0.031和0.022)，TT和CT基因型間則無顯著差異(p值為0.530)，表明T等位基因攜帶者LDL-CH水平高于C等位基因攜帶者。 主要?jiǎng)?chuàng)新點(diǎn)： 1.對(duì)中國人群Cx37基因全長3067bp進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩選，共篩選出15個(gè)SNP位點(diǎn)，其中篩選出4個(gè)未在NCBISNP數(shù)據(jù)庫登錄的潛在SNP位點(diǎn)，目前國