表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)對鼻咽癌細胞CNE1、CNE2放射增敏作用的初步研究.pdf

1、背景：
　　鼻咽癌（Nasopharyngeal carcinoma,NPC）是頭頸部常見惡性腫瘤，其發(fā)病率具有明顯的人種差異性和地域差異性，在大多數(shù)地區(qū)發(fā)病率很低，但在非洲北部、美國阿拉斯加州及中國南部發(fā)病率很高，尤其多見于中國廣東人和阿拉斯加州的因紐特人[1]。臨床上同期放化療是目前鼻咽癌治療的標準模式，早期患者五年生存率可達到80-90％，晚期患者僅為50%左右[2]。治療失敗的主要原因是局部復(fù)發(fā)和遠處轉(zhuǎn)移。因此，如何在不增

2、加周圍正常組織毒副作用的基礎(chǔ)上，進一步提高放射治療的效果是放射治療學(xué)領(lǐng)域亟待解決的難題。茶多酚是茶葉中最重要的功能成分，主要由表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin-3-gallate，ECG)、表表沒食子兒茶素(epigallocatechin，EGC)、兒茶素(epicatechin，EC)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)組成[3]。其中，EGCG是目前研究最為廣泛且深入的成

3、分。研究證實，EGCG可以通過作用于多條信號通路而對多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響。目前很多學(xué)者把它用于鼻咽癌的治療研究，并已取得巨大的進展。茶多酚在基因、蛋白、細胞不同水平上通過抑制增殖、促進凋亡、影響細胞周期而對鼻咽癌細胞產(chǎn)生抑制作用[4-5]。研究證明，茶多酚通過影響B(tài)cl-2/Bax的比率、促進cyclinD1擴增、誘導(dǎo)caspase-3基因活化從而調(diào)控鼻咽癌細胞的增殖、凋亡[6-7]。另一方面，茶多酚還能夠抑制中NF

4、-κB的活性，進而抑制NF-κB及其下游信號通路，而持續(xù)活化的NF-κB可以促進腫瘤細胞增殖、提高腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力、抑制腫瘤細胞凋亡[8]。除對多條信號通路產(chǎn)生影響外，劉青云[9]等研究表明茶多酚還能增加化療藥物敏感性，即具有化療增敏作用。茶多酚分別與5－氟尿嘧啶、順鉑、阿霉素、長春新堿聯(lián)合作用于鼻咽癌細胞后，藥物對腫瘤細胞的抑制率增加約200％，聯(lián)合方案組上述4種藥物的IC50下降50%左右，因此我們可以在保證化療藥物抗腫瘤活性的前

5、提下減少其用量，進而減少化療相關(guān)毒副反應(yīng)[10-12]。
　　隨著我們對腫瘤研究的逐漸深入，研究者們發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞群中有一小部分細胞具有高致瘤性，即極少量細胞最終都能發(fā)展成腫瘤，且表現(xiàn)出正常干細胞的特性，如自我更新能力、多向分化能力及不對稱分裂，這類細胞被稱為腫瘤起始細胞或腫瘤干細胞（Cancer stem cells,CSCs）[13]。腫瘤干細胞的發(fā)現(xiàn)使我們對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及治療有了全新的認識。放射治療作為鼻咽癌治

6、療的最重要手段，顯示出較好的療效，但放療后的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及多次放療后的放射抵抗仍是目前治療的難題。以往的抗腫瘤治療中，大多數(shù)腫瘤細胞在初次治療時被大范圍殺死，腫瘤體積因此減少，臨床上表現(xiàn)出腫塊消失腫瘤治愈。但是由于腫瘤干細胞的存在，其本身對抗腫瘤治療又表現(xiàn)出很強抵抗性，在一次大范圍殺傷中存活下來，憑借其高增殖能力成為腫瘤復(fù)發(fā)的根源。腫瘤細胞的放射抵抗涉及很多機制，其中一個可能的機制是輻射誘導(dǎo)的信號通路活化，例如NF-κB信號通路[14]。

7、另一方面，放射誘導(dǎo)的Akt促存活作用活化也被看成是癌細胞放射抵抗的一個重要因素。Akt信號通路主要促進細胞生長、抑制細胞凋亡，其與腫瘤等增生性疾病的關(guān)系非常密。輻射主要通過產(chǎn)生氧化應(yīng)激發(fā)揮其作用，已經(jīng)證實大約三分之二的放射性生物損傷是自由基介導(dǎo)的間接作用產(chǎn)生的。NF-κB是調(diào)節(jié)細胞存亡的氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子基因家族。Mn-SOD是輻射誘導(dǎo)的重要的抗氧化酶，是調(diào)節(jié)細胞轉(zhuǎn)化、腫瘤生長、應(yīng)激治療方案的一個關(guān)鍵抗氧化酶，也是公認的放射誘導(dǎo)的N

8、F-κB靶基因[15]。雖然目前國內(nèi)外關(guān)于EGCG在鼻咽癌治療中的研究甚多，但鮮少關(guān)于其放射增敏作用的研究。
　　目的：
　　本課題旨在研究 EGCG對鼻咽癌細胞是否具有放射增敏作用及其可能的機制，為EGCG的新藥開發(fā)提供理論和科研依據(jù)。
　　方法：
　　第一部分：體外培養(yǎng)CNE1、CNE2細胞，CCK-8實驗得到EGCG IC20值50μg/ml，即為實驗濃度。實驗分為4組，對照組：空白對照組；藥物組：EGCG

9、處理組；照射組：X線照射組；實驗組：EGCG聯(lián)合X線照射組。體外培養(yǎng)CNE1、CNE2細胞至對數(shù)生長期，藥物組及實驗組分別給予藥物即EGCG處理，培養(yǎng)24H后進行相應(yīng)劑量的 X線照射后收集細胞。采用克隆形成實驗檢測不同射線劑量（0、2、4、6、8、10Gy）處理后各組的克隆形成率、細胞存活率及放射增敏比（SER）。按上述相同分組，體外培養(yǎng)CNE1、CNE2細胞至對數(shù)生長期，藥物組及實驗組用50μg/mlEGCG處理，照射組及實驗組用6G

10、y X射線處理，繼續(xù)培養(yǎng)24H，流式細胞分析法檢測各組細胞的凋亡情況及細胞周期，Western bolt實驗檢測Akt蛋白的表達，RT-PCR實驗檢測Akt mRNA的表達。
　　第二部分：體外培養(yǎng)CNE1、CNE2細胞至鏡下出現(xiàn)大小均勻、生長良好的腫瘤球時，收集細胞采用上述相同的分組及處理條件，進行克隆形成實驗檢測腫瘤球抑制率，Western bolt實驗檢測Akt、NF-κB、Mn-SOD蛋白的表達，RT-qPCR實驗檢測Ak

11、t、NF-κB、Mn-SOD mRNA的表達。
　　結(jié)果：
　　第一部分：
　　1.平板克隆實驗：實驗組及照射組隨著X線劑量的逐步增加，克隆形成率也逐漸下降，細胞存活分數(shù)下降，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)（P<0.05）；相同劑量組，實驗組比照射組克隆形成率低，實驗組Do、Dq明顯低于單純照射組（P<0.05），CNE1細胞株SER為1.4962，CNE2細胞株SER為1.1846，說明EGCG具有放射增敏作用（P<0.05）。<

12、br>　　2.流式細胞分析：各實驗組與對照組相比，G2/M期百分比升高（P<0.05），表明存在G2/M期阻滯，單純射線組比單純藥物組對G2/M期的阻滯作用更明顯，二者聯(lián)合的實驗組表現(xiàn)為協(xié)同作用。
　　3.實時熒光定量實驗：各實驗組與對照組相比，Akt mRNA表達下降（P<0.05），實驗組比單純照射組及單純藥物組更明顯。
　　4.Western Bolt實驗：各實驗組與對照組相比，Akt蛋白表達均有下降（P<0.05），

13、實驗組比單純照射組及單純藥物組更明顯。
　　第二部分：
　　1.平板克隆實驗：照射組及實驗組隨著X線劑量的逐步增加，克隆形成率隨之下降，呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)（P<0.05）；相同劑量組，實驗組比照射組克隆形成率低（P<0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義。表明EGCG可以增加射線對鼻咽癌腫瘤球的抑制效應(yīng)。
　　2.PCR、Western Bolt實驗：各實驗組與對照組相比，Akt mRNA及蛋白表達下降（P<0.05），但各組間無明顯

14、差異，實驗組并沒有明顯低于放療組或藥物組（P>0.05），沒有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗組及照射組NF-κB、SOD2 mRNA及蛋白表達高于對照組及藥物組（P<0.05），但對照組與藥物組、照射組與實驗組間表達無差異（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.EGCG對鼻咽癌細胞CNE1、CNE2細胞具有放射增敏作用，其機制可能是通過抑制腫瘤細胞的增殖、促進腫瘤細胞凋亡、抑制細胞周期、抑制射線誘導(dǎo)的 Akt活化而產(chǎn)生。
　　2.E