旋毛蟲Ts21重組蛋白特性鑒定及其診斷價(jià)值與預(yù)防作用的研究.pdf

1、旋毛蟲病(trichinellosis)是由旋毛蟲(Trichinella spiralis)引起的一類嚴(yán)重的人獸共患寄生蟲病。目前用于本病免疫診斷的抗原多采用天然蟲體抗原,如可溶性抗原、排泄分泌(ES)抗原等。雖然天然抗原診斷本病的敏感性較高,但天然抗原成分非常復(fù)雜,且常與其他寄生蟲病出現(xiàn)交叉反應(yīng)。并且至今無(wú)法實(shí)現(xiàn)旋毛蟲的體外大量培養(yǎng),且難以標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)?；蛑亟M蛋白易于規(guī)?；a(chǎn),成分單一,因此具有廣泛的應(yīng)用前景。Ts21蛋白是近年來(lái)

2、發(fā)現(xiàn)的旋毛蟲ES抗原成分之一。
　　本實(shí)驗(yàn)室克隆表達(dá)了旋毛蟲(T.spiralis,T1)的Ts21蛋白。本研究對(duì)Ts21重組蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步鑒定和親和層析純化,并對(duì)其免疫診斷價(jià)值與免疫預(yù)防作用進(jìn)行了觀察。
　　材料與方法：1.旋毛蟲蟲種與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物本實(shí)驗(yàn)所用蟲種為旋毛蟲(T1)、鄉(xiāng)土旋毛蟲(f2)、布氏旋毛蟲(T3)、偽旋毛蟲(T4)及納氏旋毛蟲(T7)。不同種旋毛蟲感染小鼠血清為本實(shí)驗(yàn)室采集保存。旋毛蟲病、棘球蚴病、囊尾蚴

3、病、血吸蟲病及并殖吸蟲病患者血清均為來(lái)我室就診后確診的病人血清。4-6周齡雄性BALB/c與昆明小鼠購(gòu)自鄭州大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,在本教研室動(dòng)物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)。2.Ts21重組蛋白的表達(dá)與純化將構(gòu)建好的原核表達(dá)載體和含有目的基因的重組質(zhì)粒pMAL-c2X-Ts21用異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)后,大量收集表達(dá)菌體超聲破碎,用Amylose樹脂預(yù)裝柱進(jìn)行親和層析純化。SDS-PAGE鑒定蛋白純度,紫外分光光度法測(cè)定蛋白濃

4、度。3.Ts21重組蛋白的進(jìn)一步鑒定將純化后的Ts21重組蛋白免疫BALB/c小鼠,獲得Ts21重組蛋白免疫小鼠血清,通過(guò)免疫印跡法(Western blot)鑒定免疫血清與Ts21重組蛋白、旋毛蟲T1可溶性抗原與ES抗原的免疫反應(yīng)性;取旋毛蟲成囊前后,即感染后18d和42d的T1肌幼蟲制作石蠟切片,通過(guò)免疫熒光抗體試驗(yàn)(IFA)檢測(cè)小鼠抗Ts21重組蛋白血清與旋毛蟲成囊前后幼蟲的反應(yīng)性。4.Ts21重組蛋白免疫診斷價(jià)值的研究將純化的T

5、s21重組蛋白作為包被抗原,應(yīng)用間接ELISA法檢測(cè)感染不同種旋毛蟲感染小鼠血清、旋毛蟲病與其他寄生蟲病人血清,觀察300條T1肌幼蟲感染小鼠后2~6w血清抗體水平的變化,并對(duì)低劑量(每只小鼠感染10條與5條T1肌幼蟲)旋毛蟲感染小鼠6w后的血清抗體進(jìn)行了檢測(cè)。5.Ts21重組蛋白免疫預(yù)防作用的研究60只小鼠隨機(jī)分為3組(每組20只):免疫組(A組)、佐劑組(B組)、空白對(duì)照組(C組),免疫組應(yīng)用Ts21重組蛋白(20μg/只小鼠)加入

6、等量的弗氏完全佐劑(FCA)乳化后皮下注射,間隔10天免疫1次,共3次,第2、3次免疫用弗氏不完全佐劑(ICA):末次免疫后10d,每只小鼠尾靜脈采血,ELISA檢測(cè)抗體水平。然后用300條T1肌幼蟲攻擊感染。佐劑組以同樣體積的佐劑加等量的生理鹽水,對(duì)照組僅注射等體積生理鹽水,免疫和攻擊感染方法同上。以上3組在攻擊感染后84h和42d分別觀察腸道成蟲數(shù)和肌幼蟲數(shù),并計(jì)算減蟲率。減蟲率=(空白對(duì)照組蟲數(shù)-試驗(yàn)組蟲數(shù))/空白對(duì)照組蟲數(shù)×10

7、0％。6.ELISA應(yīng)用Ts21重組蛋白與ES抗原分別建立Ts21-ELISA與ES-ELISA,2種抗原的包被濃度均為5μg/ml,包被后用2％BSA-PBST于37℃封閉2h,血清稀釋度為1:100,每份樣本加2孔,每孔100μl。結(jié)合物為羊抗小鼠IgG(1:6000)或羊抗人IgG(1:500)。底物為鄰苯二胺(OPD)。每次試驗(yàn)時(shí)均設(shè)陽(yáng)性、陰性及空白對(duì)照。終止反應(yīng)后用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品孔的吸光度(A492nm)值。以待測(cè)樣本A值大于

8、陰性對(duì)照A值2.1倍時(shí)為陽(yáng)性。
　　結(jié)果：1.Ts21重組蛋白的特性Western blot發(fā)現(xiàn),Ts21重組蛋白免疫小鼠血清只與T1肌幼蟲可溶性抗原和ES抗原中Mr21000條帶發(fā)生陽(yáng)性反應(yīng),表明旋毛蟲Ts21是T1肌幼蟲可溶性抗原與ES抗原中的一部分。間接免疫熒光試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),Ts21重組蛋白免疫小鼠血清與旋毛蟲成囊肌幼蟲發(fā)生反應(yīng),在體壁上顯示黃綠色熒光,而與18d的成囊前期幼蟲不發(fā)生反應(yīng),提示Ts21重組蛋白的表達(dá)時(shí)期為成囊期幼

9、蟲。2.Ts21重組蛋白診斷旋毛蟲病的敏感性與特異性應(yīng)用Ts21-ELISA對(duì)T1、T2、T3、T4、T7感染小鼠血清檢測(cè)時(shí),抗體陽(yáng)性率分別為86.0％(37/43)、16.7％(3/18)、7.1％(1/14)、36.4％(4/11)及36.4(4/11);應(yīng)用ES-ELISA檢測(cè)T1、T2、T3、T4、T7感染小鼠血清的抗體陽(yáng)性率分別為88.4％(38/43)、88.9％(16/18)、92.9％(13/14)、63.6％(7/11

10、)、81.8％(9/11)。Ts21重組蛋白與ES抗原檢測(cè)T1感染小鼠血清的敏感性無(wú)顯著性差異(X2=0.104,P>0.05),但ES抗原與其他種旋毛蟲感染小鼠血清的交叉反應(yīng)率明顯高于Ts21重組蛋白(X2=17.069,P<0.05)。Ts21-ELISA檢測(cè)旋毛蟲病人的血清抗體陽(yáng)性率為94.7％(18/19),并殖吸蟲病、棘球蚴病、囊尾蚴病及血吸蟲病血清的交叉反應(yīng)率分別為10.5％(3/19)、7.7％(1/13)、16.7％(1

11、/6)、0％(0/4);ES-ELISA檢測(cè)旋毛蟲病人的血清抗體陽(yáng)性率為100％(19/19)、上述其他寄生蟲病人血清的交叉反應(yīng)率分別為10.5％(2/19)、23.1(3/19)、0％(0/6)、0％(0/4)。Ts21重組蛋白與ES抗原檢測(cè)旋毛蟲病患者血清的敏感性與特異性均無(wú)顯著性差異(X2=0.000,P>0.05;X2=0.010,P>0.05)。3.Ts21重組蛋白對(duì)不同劑量旋毛蟲感染小鼠后不同時(shí)間的檢測(cè)300條T1肌幼蟲感染

12、10只小鼠后2w、3w,Ts21-ELISA陽(yáng)性率分別為20％和60％,感染后4~6w陽(yáng)性率均為100％;應(yīng)用ES-ELISA檢測(cè)時(shí),感染后2w、3w的小鼠血清抗體陽(yáng)性率分別為20％和40％,感染后4~6w的陽(yáng)性率均為100％。Ts21-ELISA與ES-ELISA對(duì)10條T1肌幼蟲感染的10只小鼠血清檢測(cè)時(shí),抗體陽(yáng)性率分別為90％和100％(X2=0.000,P>0.05);兩種抗原對(duì)5條T1肌幼蟲感染的10只小鼠血清檢測(cè)時(shí),抗體陽(yáng)性

13、率均為100％。4.Ts21重組蛋白的免疫預(yù)防作用Ts21重組蛋白末次免疫小鼠后10d的血清抗體滴度為1:106。攻擊感染后84h,免疫組、佐劑組及對(duì)照組的腸道成蟲數(shù)分別為43.60±20.07、68.70±28.54及76.10±17.67,免疫組與佐劑組及對(duì)照組之間均有顯著性差異(P<0.05),免疫組與佐劑組的成蟲減蟲率分別為42.71％和9.72％。攻擊感染后42d,免疫組、佐劑組及對(duì)照組的肌幼蟲數(shù)分別為16973.80±711

14、1.06、32205.00±12145.33及33812.50±24703.42,免疫組與佐劑組及對(duì)照組之間均有顯著性差異(P<0.05),免疫組與佐劑組的肌幼蟲減蟲率分別為49.80％和4.75％。
　　結(jié)論：1.旋毛蟲Ts21蛋白是旋毛蟲肌幼蟲ES抗原的一部分,該蛋白在成囊期幼蟲表達(dá),但在成囊前期幼蟲不表達(dá)。2.旋毛蟲Ts21重組蛋白與ES抗原檢測(cè)旋毛蟲感染小鼠血清的敏感性相似,特異性優(yōu)于ES抗原;兩種抗原檢測(cè)旋毛蟲病患者血清