溶血磷脂酸信號(hào)在出生后心臟發(fā)育中的變化及其生物學(xué)功能的探討.pdf

1、近年來先天性心臟?。ㄏ刃牟。┌l(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，已成為我國出生缺陷的首位病種，外科矯治是根治先心病最主要的手段，但由于我國特殊的實(shí)際情況使得先心病的外科治療面臨許多亟待解決的問題。先心病外科治療的主要時(shí)間窗是出生后，雖然心臟在出生時(shí)已經(jīng)完成大體結(jié)構(gòu)的發(fā)育，但在功能上尚需經(jīng)歷出生后一定時(shí)間的生長方可達(dá)到成熟，對(duì)出生后心臟的發(fā)育特點(diǎn)和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究無疑是先天性心臟病外科干預(yù)研究的首要任務(wù)。雖然心臟在胚胎期的發(fā)育過程已經(jīng)得到廣泛的研究，但是

2、對(duì)于出生后未成熟心肌經(jīng)歷怎樣的過程轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒煨募∫约罢{(diào)控這種轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵機(jī)制卻知之甚少。
　　 溶血磷脂酸(lysophosphatidica cid，LPA)是一類內(nèi)源性生物活性脂類信號(hào)分子，屬于溶血磷脂(lysophospholipids)分子的重要成員，通過其特異性G蛋白耦聯(lián)受體發(fā)揮廣泛的生物學(xué)效應(yīng)。雖然LPA受體在哺乳動(dòng)物胚胎心臟中的表達(dá)早有報(bào)道，但LPA及其介導(dǎo)的信號(hào)通路在心臟發(fā)育過程中究竟發(fā)揮什么功能卻至今不明。本研究

3、在課題組以往研究的基礎(chǔ)上，為進(jìn)一步探索LPA信號(hào)在心血管系統(tǒng)中的作用，尤其是出生后心臟發(fā)育成熟中的角色，首先對(duì)目前已經(jīng)確認(rèn)的所有溶血磷脂受體（包括LPA的5種受體以及另一種溶血磷脂分子1磷酸鞘胺醇(S1P)的5種受體）從胚胎末期到成年期在大鼠心臟的表達(dá)變化進(jìn)行了分析，然后依據(jù)發(fā)育表達(dá)譜所提供的線索，對(duì)LPA在出生后心臟成熟過程中可能參與調(diào)控的生物學(xué)過程進(jìn)行了功能學(xué)探索。
　　 研究?jī)?nèi)容主要包括三部分：
　　 第一部分溶血

4、磷脂受體在大鼠心臟發(fā)育中變化——從胚胎末期到成年期
　　 這部分研究主要通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR、Western Blot和組織免疫化學(xué)的方法對(duì)10種溶血磷脂受體（Lpar1-5和Slpr1-5）在大鼠心臟中從胚胎末期到成年期的表達(dá)變化進(jìn)行了分析，主要研究發(fā)現(xiàn)包括：
　　 (1)Lpar1、Lpar3、Lpar4、S1pr1、Slpr2、Slpr3為大鼠心臟主要的溶血磷脂受體亞型；
　　 (2)Lpar1、Lpar

5、3和Lpar4的表達(dá)在出生后心臟發(fā)育過程呈現(xiàn)明顯的發(fā)育變化，在出生后2-3周內(nèi)的表達(dá)顯著高于之后的表達(dá)，提示可能與出生后心臟功能的成熟相關(guān)；
　　 (3)Lpar1和Lpar4在出生后1周表達(dá)明顯增加，之后迅速下降，提示可能與出生后早期由于心肌細(xì)胞增殖而表現(xiàn)的心臟快速生長有關(guān)；
　　 (4)Lpar3在出生后1天的主動(dòng)脈壁和冠狀血管壁呈現(xiàn)高表達(dá)，提示LPA-Lpar3可能參與心臟血管的發(fā)育；
　　 (5)S1pr

6、1、S1pr2、S1pr3雖然在心臟高表達(dá)，但在出生后心臟發(fā)育過程中其表達(dá)并沒有發(fā)生明顯變化，提示S1P信號(hào)對(duì)心臟功能具有重要調(diào)節(jié)作用但在發(fā)育過程中并不發(fā)生角色轉(zhuǎn)換。
　　 第二部分溶血磷脂酸對(duì)未成熟心肌細(xì)胞的促增殖作用及其信號(hào)機(jī)制初探
　　 這部分研究在第一部分研究基礎(chǔ)上探討LPA及其受體是否調(diào)節(jié)了出生后早期未成熟心肌細(xì)胞的增殖過程。利用免疫熒光標(biāo)記心肌細(xì)胞直接計(jì)數(shù)和細(xì)胞增殖標(biāo)志物Ki67，我們首次發(fā)現(xiàn)LPA不僅對(duì)出生

7、后早期仍有增殖能力的P1d心肌細(xì)胞具有促增殖作用，并且對(duì)已經(jīng)失去增殖能力的P4d心肌細(xì)胞同樣具有明顯的促增殖作用，并且均呈現(xiàn)劑量依賴和時(shí)間依賴關(guān)系。Lpar3受體特異性激動(dòng)劑OMPT對(duì)未成熟心肌細(xì)胞具有顯著的促增殖作用，而Lpar1/Lpar3的拮抗劑Ki16425則可以完全阻斷LPA的促增殖作用，同時(shí)，Lpar1、Lpar3和Lpar4在心臟不同細(xì)胞的表達(dá)分布顯示Lpar3在心肌細(xì)胞的表達(dá)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于心臟成纖維細(xì)胞，而Lpar1和Lpar

8、4則恰好相反，提示Lpar3可能主要參與了心肌細(xì)胞的功能調(diào)節(jié)，而Lpar1和Lpar4則主要介導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng)，由此，我們認(rèn)為LPA可能是通過Lpar3介導(dǎo)了其對(duì)未成熟心肌細(xì)胞的促增殖作用。另外，LPA及其受體信號(hào)的激活可使進(jìn)入S期的心肌細(xì)胞明顯增加，提示LPA信號(hào)可能通過影響心肌細(xì)胞周期的進(jìn)程發(fā)揮促增殖作用。
　　 第三部分溶血磷脂酸對(duì)出生后心肌細(xì)胞收縮及興奮-收縮耦聯(lián)的影響
　　 這部分研究仍然是以第一部

9、分的研究結(jié)果為線索，力圖證明在心肌收縮功能尚未成熟時(shí)，LPA可以通過促進(jìn)肌細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的增加參與心肌收縮興奮-收縮耦聯(lián)過程進(jìn)而促進(jìn)心肌細(xì)胞的收縮。但是，通過本部分研究我們沒能證實(shí)最初的研究假設(shè)，但仍然有以下重要的研究發(fā)現(xiàn)：
　　 (1)不同于研究假設(shè)的是，LPA對(duì)出生后14天大鼠心肌細(xì)胞的收縮和鈣瞬變均沒有顯著影響，但符合研究假設(shè)的是，LPA不影響出生后21天大鼠心肌細(xì)胞的收縮和鈣瞬變，表明LPA信號(hào)并不參與出生后14-21

10、天大鼠心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)過程和心肌細(xì)胞收縮；
　　 (2)在大鼠出生后發(fā)育過程中，Lpar1、Lpar3和Lpar4在整體心臟表達(dá)下調(diào)的時(shí)間點(diǎn)與在心肌細(xì)胞的下調(diào)時(shí)間點(diǎn)并不一致，由整體心臟的出生后21天提前到心肌細(xì)胞的出生后14天，提示在出生后14天LPA受體對(duì)心肌細(xì)胞的發(fā)育調(diào)節(jié)功能可能即己減弱或消失；
　　 (3)大鼠心臟的左室射血分?jǐn)?shù)在出生后14天即保持穩(wěn)定，與成年心臟呈現(xiàn)相同的水平，表明大鼠心肌收縮功能可能在出

11、生后14天已達(dá)到成熟。
　　 綜合此3點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，我們認(rèn)為本研究的部分假設(shè)——當(dāng)心肌功能成熟時(shí)，LPA所介導(dǎo)的鈣信號(hào)減弱甚至消失，不再參與成熟心肌細(xì)胞的興奮-收縮耦聯(lián)和收縮過程——可能仍然是成立的。
　　 總之，本研究探索了一種內(nèi)源性生物活性分子——LPA在出生后心臟發(fā)育成熟中變化及其對(duì)未成熟心肌細(xì)胞增殖和收縮的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)了LPA信號(hào)對(duì)心血管系統(tǒng)的新的生物學(xué)調(diào)節(jié)功能，加深了對(duì)未成熟心肌生長調(diào)節(jié)的認(rèn)識(shí)，為先心病的外科治