高脂飲食老年大鼠骨骼肌脂肪酸轉(zhuǎn)運與IR相關(guān)機制及藥物干預的研究.pdf

1、流行病學資料表明，2型糖尿病患病率隨年齡增加而上升。胰島素抵抗(insulin resistance，IR)和胰島β細胞功能受損是2型糖尿病的主要發(fā)病機制。 研究發(fā)現(xiàn)，老年內(nèi)臟脂肪增加使2型糖尿病和心血管發(fā)病率增加，其中飲食是重要促發(fā)因素之一。長期高脂飲食的人群IR和2型糖尿病發(fā)病率明顯高于正常人群。 本課題通過觀察老年大鼠和給予高脂飲食喂養(yǎng)后骨骼肌脂肪酸代謝情況，研究骨骼肌中脂肪酸轉(zhuǎn)運關(guān)鍵酶FAT/CD36和CPTⅠβ的表達及

2、胰島素信號轉(zhuǎn)導通路中PKB和GLUT4的表達，探索老年大鼠骨骼肌脂肪酸轉(zhuǎn)運有關(guān)的代謝異常與IR形成的機制；通過對高脂喂養(yǎng)老年大鼠羅格列酮藥物干預，探討羅格列酮改善IR的新機制，為改善老年IR狀態(tài)、降低糖尿病的發(fā)生和延緩衰老提供一個新的研究方向。本實驗內(nèi)容主要包括以下四部分： 第一部分高脂飲食對老年大鼠骨骼肌脂肪酸代謝和胰島素敏感性的影響及羅格列酮的干預研究 目的：探討老年和高脂飲食及羅格列酮干預對大鼠胰島素敏感性和骨骼肌

3、內(nèi)脂質(zhì)的影響，并對骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)與胰島素抵抗進行相關(guān)性分析。 方法：22-24月齡老年雄性Wistar大鼠40只隨機分為2組：老年對照(OC)組16只、高脂(HF)組24只，4-5月齡青年大鼠16只，為青年對照組(YC)。對照組給予基礎飼料，熱量組成：碳水化合物65.5％，脂肪10.3％，蛋白質(zhì)24.2％，總熱量為348kcal/100g；m組給予高脂飼料，其熱量組成：碳水化合物20.1％，脂肪59.8％，蛋白質(zhì)20.1％，總熱量

4、為501kcal/100g；給予老年兩組大鼠每日等熱量投喂飼料，每周稱體重1次，喂養(yǎng)八周。于喂養(yǎng)第四周末心臟采血測空腹血糖(FBG)，胰島素(INS)。血清甘油三酯(TG)，血清總膽固醇(TC)，游離脂肪酸(FFA)的含量。喂養(yǎng)四周末，每組均隨機選8只行口服葡萄糖耐量實驗(OGTT)評價大鼠對葡萄糖負荷的耐受情況，行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗判斷胰島素抵抗情況，判斷造模成功后高脂組隨機分為2組：高脂組和羅格列酮干預組(RSG)，每組8只

5、，除繼續(xù)給予高脂飼料外RSG組給予羅格列酮3mg/kg灌胃，高脂組給予等量生理鹽水灌胃，繼續(xù)喂養(yǎng)四周。實驗第八周末，行OGTT實驗和高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗評價各組胰島素抵抗情況，實驗前抽取血樣用于測定血清各項指標；實驗結(jié)束后頸動脈放血處死動物，立即取出股四頭肌和脂肪組織放入液氮中冷凍，然后保存于-70℃低溫冰箱。骨骼肌甘油三酯(TGm)經(jīng)氯仿/甲醇抽提后用全自動生化分析儀測定，骨骼肌長鏈酯酰輔酶A(LCACoA)用熒光分光光度計測定

6、。 結(jié)果： 1. 各組一般項目的比較：與青年組相比，老年組大鼠體重增加，高脂組和羅格列酮干預組體重與老年組相比變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05)。與青年組相比，老年組空腹胰島素、空腹血糖和游離脂肪酸在喂養(yǎng)第八周均升高；與老年組比較，高脂組空腹胰島素、空腹血糖、游離脂肪酸、總膽固醇和甘油三酯明顯升高；羅格列酮干預組空腹胰島素、空腹血糖、游離脂肪酸、總膽固醇和甘油三酯與高脂組比較均下降，差異均有統(tǒng)計學意義(p<0.

7、05或p<0.01)。 2. 在第四周和第八周，與青年組相比，老年組TGm和LCACoA含量明顯升高(p<0.05)；與老年組相比，高脂組TGm和LCACoA含量進一步明顯升高，且隨喂養(yǎng)時間的延長，高脂組喂養(yǎng)第八周TGm和LCACoA含量明顯高于第四周(p<0.05或p<0.01)；羅格列酮干預組TGm和LCACoA含量與高脂組相比明顯下降(p<0.05或p<0.01)。 3. 胰島素抵抗的評價：在喂養(yǎng)第四周和第八周，與

8、青年組相比，老年組鉗夾實驗的葡萄糖輸注率降低(p<0.01)；與老年組相比，高脂組葡萄糖輸注率明顯下降；隨喂養(yǎng)時間延長，第八周時高脂組內(nèi)葡萄糖輸注率與第四周相比明顯下降(p<0.01)；羅格列酮干預組葡萄糖輸注率與高脂組相比明顯升高(p<0.01)。 4. OGTT實驗結(jié)果：與青年組比較，無論第四周或第八周老年組大鼠60'、120'血糖和葡萄糖曲線下面積(AUC)均升高(p<0.05或p<0.01)。與老年組比較，高脂喂養(yǎng)第四周

9、120'血糖和AUC升高，高脂喂養(yǎng)第八周各時間點血糖和AUC均升高，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01)；高脂喂養(yǎng)第八周0'、60'、120'血糖和AUC明顯高于第四周，羅格列酮干預組各時間點血糖和AUC均下降，差異有統(tǒng)計學意義(p<0.05或p<0.01)。 5. 相關(guān)結(jié)果表明：葡萄糖輸注率與空腹胰島素、游離脂肪酸和骨骼肌甘油三酯和長鏈脂酰輔酶A明顯負相關(guān)(p<0.05或p<0.01)。 結(jié)論： 1. 老年大鼠骨骼

10、肌甘油三酯和長鏈脂酰輔酶A含量明顯高于青年大鼠，葡萄糖輸注率和口服糖耐量在老年組明顯減低，表明老年大鼠更易發(fā)生骨骼肌脂肪堆積和胰島素抵抗。 2. 高脂飲食可誘導老年大鼠骨骼肌甘油三酯和長鏈脂酰輔酶A含量進一步升高，葡萄糖輸注率和口服糖耐量進一步降低，說明高脂飲食可加重老年骨骼肌脂肪酸代謝異常及胰島素抵抗。 3. 相關(guān)分析表明葡萄糖輸注率和骨骼肌脂質(zhì)明顯負相關(guān)，說明脂代謝紊亂參與了年齡和飲食誘導的胰島素抵抗的發(fā)生。

11、 4. 羅格列酮可以降低高脂誘導老年胰島素抵抗大鼠骨骼肌甘油三酯和長鏈脂酰輔酶A含量，使OGTT各點血糖和AUC下降及增加葡萄糖輸注率，改善胰島素抵抗。 第二部分高脂飲食和羅格列酮干預對老年大鼠骨骼肌FAT/CD36和CPT Ⅰβ表達的影響 目的：探討是否隨年齡增長及高脂的環(huán)境因素影響了骨骼肌脂肪酸轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵酶FAT/CD36和CPTⅠβ的表達及與骨骼肌脂質(zhì)的相關(guān)性研究，觀察羅格列酮干預對FAT/CD36和CPTⅠβ表達

12、的影響。 方法：動物分組及標本取得同第一部分。骨骼肌FAT/CD36mRNA表達采用實時熒光定量RT-PCR分析技術(shù)，CPTⅠβmRNA表達采用半定量RT-PCR分析技術(shù)，采用TRIZOL提取組織總RNA，鑒定RNA完整性，測定其在260nm和280nm的吸光度值(OD)。以完整性較好且OD260/OD280在1.8～2.0的RNA進行RT-PCR。Western-blot法分析FAT/CD36蛋白表達。 結(jié)論：

13、 1. 與青年組相比，老年組大鼠骨骼肌細胞FAT/CD36mRNA和蛋白表達升高可能是老年組易發(fā)生脂質(zhì)沉積的原因。 2. 高脂飲食可使骨骼肌FAT/CD36mRNA和蛋白表達明顯增加和CPTⅠβmRNA表達下降，可能導致飲食誘導骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)沉積原因之一。 3. 骨骼肌內(nèi)長鏈酯酰輔酶A與FAT/CD36mRNA表達呈正相關(guān)，與CPTⅠβmRNA表達負相關(guān)，說明老年高脂大鼠骨骼肌脂質(zhì)堆積與脂肪酸轉(zhuǎn)運關(guān)鍵酶的表達異常有關(guān)。

14、 4. 羅格列酮干預使骨骼肌FAT/CD36mRNA和蛋白表達降低和CPTⅠβmRNA表達升高，可能相應減少骨骼肌脂質(zhì)堆積，改善胰島素抵抗。 第三部分老年高脂飲食大鼠骨骼肌脂肪酸含量與PKB、GLUT4表達的相關(guān)性研究及羅格列酮干預影響 目的：探討老年和高脂環(huán)境因素對骨骼肌PKB和GLUT4mRNA和蛋白表達影響及羅格列酮干預的影響，并對骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)與PKB和GLUT4表達的量進行了相關(guān)分析，以了解骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)對胰島

15、素信號轉(zhuǎn)導的影響。 方法：動物分組及標本取得同第一部分。骨骼肌PKB和GLUT4mRNA表達采用實時熒光定量RT-PCR分析技術(shù)，PKB和GLUT4蛋白表達用Western-blot分析。 結(jié)論：1. 與青年組相比，老年組大鼠骨骼肌細胞PKBmRNA和蛋白表達下降，GLUT4mRNA和蛋白表達也下降，可能是老年組易出現(xiàn)胰島素信號轉(zhuǎn)導異常，胰島素抵抗的發(fā)生增加。 2. 高脂飲食可誘導PKBmRNA和蛋白表達及GLU

16、T4mRNA和蛋白表達進一步下降，說明高脂環(huán)境因素可通過影響胰島素信號轉(zhuǎn)導的關(guān)鍵酶而促進胰島素抵抗的形成。 3. 相關(guān)分析表明，PKBmRNA表達的量與葡萄糖輸注率明顯正相關(guān)，GLUT4mRNA表達的量與骨骼肌內(nèi)LCACoA負相關(guān)，和葡萄糖輸注率正相關(guān)，說明骨骼肌內(nèi)脂質(zhì)通過影響胰島素信號轉(zhuǎn)導通路的關(guān)鍵酶參與胰島素抵抗的形成。 4. 羅格列酮干預可使高脂喂養(yǎng)老年大鼠骨骼肌PKBmRNA和蛋白表達及GLUT4mRNA和蛋白表

17、達升高，可能是改善老年胰島素抵抗的機制之一。 第四部分高脂飲食和羅格列酮干預對老年大鼠脂肪和骨骼肌PPARγ表達的影響 目的：通過觀察高脂喂養(yǎng)老年大鼠脂肪和骨骼肌組織PPARγ的表達情況，探討高脂飲食老年大鼠骨骼肌脂質(zhì)代謝紊亂和羅格列酮改善胰島素抵抗的機制。 方法：動物分組及標本取得同第一部分。脂肪和骨骼肌組織PPARγmRNA表達采用實時熒光定量RT-PCR技術(shù)，脂肪和骨骼肌組織PPAR蛋白表達用Western

18、-blot分析。 結(jié)論：1. 與青年組相比，老年組大鼠脂肪組織PPARγ mRNA和蛋白表達下降可能是老年脂肪酸代謝紊亂胰島素抵抗發(fā)生增加原因之一。 2. 高脂飲食可誘導老年大鼠脂肪組織和骨骼肌組織PPARγmRNA和蛋白表達下降，可能參與飲食誘導的骨骼肌脂肪酸代謝異常和胰島素抵抗的形成。 3. 羅格列酮干預可使高脂喂養(yǎng)老年大鼠骨骼肌和脂肪組織PPARγ mRNA。和蛋白表達升高，可能是改善老年胰島素抵抗的機制之