羅漢果莖尖的包埋脫水法超低溫保存及其蛋白質(zhì)組研究.pdf

1、包埋脫水法技術(shù)基于人工種子技術(shù)發(fā)展而來，采用海藻酸鈣對樣本進(jìn)行包裹，使樣本免受化學(xué)藥劑的毒害與脫水的損害。包埋脫水法有著實驗操作簡單，成本低，存活率高的優(yōu)點。羅漢果(Siraitia grosvenorii)是中國特有的一種植物，果實有著重要藥用與食用價值，目前對羅漢果進(jìn)行超低溫種質(zhì)保存的研究較少。本文應(yīng)用單因素實驗與正交實驗對4個品種羅漢果（龍脊，冬瓜漢，青冠，柏林3號）的莖尖進(jìn)行了包埋脫水法的超低溫保存研究，并對保存過程中羅漢果莖尖

2、進(jìn)行蛋白質(zhì)組雙向電泳及差異分析和質(zhì)譜鑒定，探討包埋脫水法保存對其基因表達(dá)調(diào)控的影響，可為羅漢果種質(zhì)超低溫保存提供分子基礎(chǔ)和理論依據(jù)。主要研究結(jié)果如下:
　　單因素實驗:
　　1.對超低溫保存預(yù)培養(yǎng)時間進(jìn)行比較，結(jié)果表明，預(yù)培養(yǎng)2d最佳，存活率為55％。
　　2.不同的預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度處理表明，0.6mol/L蔗糖處理冬瓜漢莖尖效果最好，存活率為58％。
　　3.在不同蔗糖濃度的預(yù)培養(yǎng)試劑中添加10％的甘油，冬瓜漢莖

3、尖在0.6mol/L蔗糖+10％甘油時保存效果最好，存活率為78％。
　　4.隨冬瓜漢莖尖包埋珠脫水時間延長，脫水小于4h的存活率不到10％，然后存活率上升，至脫水6h時達(dá)峰值(61％)，此時的水分含量為23％。
　　正交實驗:
　　5.對影響超低溫保存的三個重要因素:預(yù)培養(yǎng)蔗糖濃度，預(yù)培養(yǎng)時間與脫水時間對羅漢果的冬瓜漢品種進(jìn)行正交實驗，篩選出的最佳保存條件為:0.6mol/L蔗糖預(yù)培養(yǎng)1d，常溫下脫水6h，最高存活率

4、60％。將其應(yīng)用于冬瓜漢、青冠、伯林3號、龍脊4個品種，存活率分別為60％，42％，45％和53％，青冠和伯林3號兩個品種較為接近。
　　6.對液氮冷凍后、液氮冷凍前和繼代（對照）的羅漢果莖尖的蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，蛋白質(zhì)組雙向電泳，2-DE圖譜分析測定，結(jié)果表明，3組的蛋白質(zhì)數(shù)量有明顯差異，冷凍組蛋白質(zhì)點數(shù)日在1400～1500之間，未冷凍組在1900～2000之間，對照組在2200～2400之間;蛋白質(zhì)覆蓋率最低60％，最高為84％

5、，而實驗組組內(nèi)對比中，最低76％，最高84％，顯示實驗重復(fù)性都較高。
　　7.對3組實驗的2-DE圖譜進(jìn)行差異分析顯示:超低溫保存產(chǎn)生了差異蛋白，冷凍組與對照組差異性大，共有283個蛋白差異位點，其次是未冷凍組與對照組，測得181個蛋白差異位點，冷凍組與未冷凍組差異最小，有72個蛋白差異位點。
　　8.根據(jù)蛋白質(zhì)組差異分析，從中選定21個蛋白質(zhì)(A23、A08、C10、B01、C19、D60、D111、D119、D134、D

6、124、D136、D163、E84、C21、C49、C58、D61、D128、E57、B18、D44)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定鑒定結(jié)果:A23為蘋果酸脫氫酶;A08為谷氨酰胺合成酶;C10為熱休克蛋白70;B01為Patellin1;C19為Ⅱ型伴侶蛋白CPN60-2，D60為26S蛋白酶體非ATP酶調(diào)節(jié)亞基（片段）;D111為二磷酸核酮糖羧化酶;D119為甘油醛-3-磷酸脫氫酶;D134為S-腺苷基甲硫氨酸（片段）;D124為錨蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域蛋白