菊芋品種莖尖超低溫保存研究.pdf

1、菊芋（Helianthus tuberous L.）屬菊科向日葵屬多年生草本植物，具有很強(qiáng)的抗逆性，多用于東北地區(qū)高速路綠化，常作為改善沙漠、鹽堿地的綠化植被，菊芋還具有很高的經(jīng)濟(jì)價值、觀賞價值、生態(tài)價值和藥用價值，是一種重要的觀賞和作物種質(zhì)資源。菊芋品種較多，常為無性繁殖，采用超低溫保存可以長期保存菊芋種質(zhì)資源。
　　本研究以菊芋品種‘2009331028’為試驗材料，以單因素試驗優(yōu)化菊芋莖尖小滴玻璃化法超低溫保存體系，并將該體

2、系應(yīng)用到‘M6’、‘Stampede’和‘Relikt’這3個菊芋品種中，還比較了菊芋莖尖玻璃化法和小滴玻璃化法超低溫保存效果;采用差示掃描量熱法(DSC)檢測不同處理階段莖尖的熱力學(xué)變化和透射電鏡觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化;最后利用SSR分子標(biāo)記檢測超低溫保存后再生植株的遺傳穩(wěn)定性。主要研究結(jié)果如下:
　　1.菊芋莖尖超低溫保存最優(yōu)化體系為:取繼代培養(yǎng)4-5周的菊芋試管苗‘2009331028’，剝?nèi)?-3mm大小的無菌莖尖分別在含

3、0.4 mol/L蔗糖的MS液體培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)3d，25℃下裝載30min，0℃下PVS2脫水處理15min，小滴玻璃化法進(jìn)行超低溫保存至少24h，在1.2M蔗糖的液體MS卸載液中解凍20min，每10min換液一次，將解凍后的莖尖轉(zhuǎn)入恢復(fù)培養(yǎng)基中暗培3～5d后轉(zhuǎn)入光照強(qiáng)度1500lux，16h/8h光周期下培養(yǎng)，存活率和再生率分別為93％和83％。
　　2.運(yùn)用最優(yōu)化方案對菊芋莖尖進(jìn)行玻璃化法和小滴玻璃化法超低溫保存后，其存活率

4、分別為34％和93％，再生率分別為26％和83％。菊芋莖尖超低溫保存的最佳方法為小滴玻璃化法。
　　3.運(yùn)用最優(yōu)化方案對‘M6’、‘Stampede’和‘Relikt’這3個菊芋品種進(jìn)行小滴玻璃化法超低溫保存，存活率分別為44％、72％、50％，再生率分別為37％、53％、37％，品種間存在差異。
　　4.根據(jù)DSC掃描圖譜顯示，新鮮莖尖，預(yù)培養(yǎng)的莖尖，預(yù)培養(yǎng)、裝載后的莖尖在降溫的過程中都形成冰晶，且結(jié)冰的溫度和冰晶的體積隨

5、著處理的加劇而逐漸降低和減小，放出的熱量也相應(yīng)減小。當(dāng)莖尖經(jīng)過PVS2脫水處理，發(fā)生了相變潛熱即玻璃化轉(zhuǎn)變，4個菊芋品種的DSC結(jié)果一致，玻璃化轉(zhuǎn)變溫度相近。
　　5.透射電鏡觀察了菊芋品種‘2009331028’的8個不同處理的莖尖的超微結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)脫水主要發(fā)生在裝載和PVS2處理階段，菊芋莖尖經(jīng)過預(yù)培養(yǎng)和裝載后，細(xì)胞中出現(xiàn)質(zhì)壁分離，胞內(nèi)小泡增多，核質(zhì)濃縮，核仁皺縮，線粒體、葉綠體等細(xì)胞器出現(xiàn)空洞或扭曲變形，而經(jīng)過PVS2處理的莖