姜黃素聯(lián)合5-氟尿嘧啶對HepG2細(xì)胞PI3K-AKT信號通路及相關(guān)調(diào)控分子的影響.pdf

1、肝細(xì)胞癌（肝癌）是最常見的惡性腫瘤之一，在發(fā)展中國家有很高的發(fā)病率。盡管在過去的幾十年里，肝癌的治療效果有所提高，但由于肝癌起病隱匿，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移較早和復(fù)發(fā)率較高，而且肝癌細(xì)胞對常用的抗腫瘤藥物和放療等治療措施不敏感，導(dǎo)致肝癌的預(yù)后仍然很差。因此，進(jìn)一步尋找和開發(fā)新的治療策略是非常必要和急迫的。5-氟尿嘧啶（5-FU）是一種嘧啶類抗癌藥物。自從被發(fā)現(xiàn)以來，5-FU在腫瘤化療領(lǐng)域占據(jù)重要地位。尤其對惡性腫瘤非常有效，是多種癌癥（如肝，胃，胰腺

2、癌和乳腺癌）廣泛使用的化療藥物，但肝癌細(xì)胞對5-FU不是特別敏感，因此如何提高肝癌細(xì)胞對5-FU的敏感性是非常重要的課題。姜黃素是從姜科植物姜黃中提取的一種色素?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)姜黃素的主要藥理作用有抗氧化、抑制炎癥反應(yīng)及抑制腫瘤生長。近年來許多研究表明，人類的多種腫瘤如胃癌、大腸癌、乳腺癌、肝癌、腎癌的發(fā)病都與PI3K/AKT信號通路密切相關(guān)，PI3K/AKT信號通路不僅可以調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的凋亡，而且可以調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中多種細(xì)胞因子和炎癥因

3、子的表達(dá)，從而發(fā)揮對腫瘤細(xì)胞或組織的影響，而且最近研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路可以通過調(diào)控免疫細(xì)胞或免疫分子作用干預(yù)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。AKT又稱蛋白激酶B(PKB)，是PI3K/AKT信號通路中關(guān)鍵的信號分子，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在細(xì)胞存活和凋亡中發(fā)揮重要作用。PI3K屬于胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶家族成員，它能特異地使磷脂酰肌醇和磷酸肌醇上第3位羥基基團(tuán)磷酸化。PTEN(phosphataseandtensinhomologd

4、eletedonchromosometen),即人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因，為新發(fā)現(xiàn)的一種抑癌基因，位于第10號染色體q23.3，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為515kbmRNA。PTEN屬于PTP(proteintyrosinephosphatases)基因家族成員。PTEN基因可以調(diào)控腫瘤抑制因子的合成，通過阻止細(xì)胞過快的生長和分裂，進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞分裂周期。有證據(jù)顯明，PTEN還具有協(xié)助控制細(xì)胞轉(zhuǎn)移、細(xì)胞與周圍組織的粘附和血管發(fā)生等

5、功效。此外，PTEN還在維持細(xì)胞遺傳信息的穩(wěn)定性上具有重要作用。因而PTEN基因是眾多腫瘤預(yù)后的評價指標(biāo)，研究其作用機(jī)制對腫瘤的診斷及其基因治療具有重要意義。Toll樣受體(Toll-likereceptors，TLR)是參與非特異性免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR能夠監(jiān)視與識別各種不同的疾病相關(guān)分子模式(PAMP)，是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障。TLR是單個的跨膜非催化性蛋白質(zhì)，可以識別來源

6、于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子。當(dāng)微生物突破機(jī)體的物理屏障，如皮膚、粘膜等時，TLR可以識別它們并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答。其中TLR4不但可識別外源的病原體，還可識別內(nèi)源性物質(zhì)及降解物。新近研究發(fā)現(xiàn)，TLR能結(jié)合機(jī)體自身產(chǎn)生的一些內(nèi)源性分子。免疫佐劑可增強(qiáng)抗腫瘤免疫，其分子和細(xì)胞機(jī)制得到進(jìn)一步闡明，TLR也在其中扮演重要角色。由于腫瘤在發(fā)生發(fā)展過程中可以產(chǎn)生一些能被識別的內(nèi)源性配體，所以TLR在腫瘤免疫監(jiān)視中可能發(fā)揮了一定作用。TLR4

7、可以識別革蘭氏陰性菌脂多糖(LPS)，還可識別宿主壞死細(xì)胞釋放的熱休克蛋白(heat-shockproteins，HSP)，體內(nèi)類肝素硫酸鹽和透明質(zhì)酸鹽降解的多糖部分，以及局部的內(nèi)源性酶的級聯(lián)活化反應(yīng)也可激活TLR4。近年研究顯示TLR4在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。本研究通過探討抗腫瘤藥物聯(lián)合姜黃素對肝癌細(xì)胞的抑制作用和對PI3K/AKT信號通路及相關(guān)分子的影響，來闡明姜黃素對常用化療藥的增敏作用及其相關(guān)機(jī)制。
　　 目

8、的:研究5-FU單用或聯(lián)合姜黃素對HepG2細(xì)胞PI3K/AKT信號通路及相關(guān)調(diào)控分子AKT、PTEN和TLR4的影響。
　　 方法:實(shí)驗(yàn)分兩部分。第一部分:5-FU單用或聯(lián)合姜黃素對HepG2細(xì)胞PI3K/AKT信號通路及相關(guān)調(diào)控分子AKT、PTEN和TLR4的影響。選用HepG2肝癌細(xì)胞用于研究，體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，取對數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)，將HepG2細(xì)胞接種在96孔板中，培養(yǎng)48小時后分別加入不同濃度的姜黃素5umo

9、l/L、10umol/L、20umol/L、40umol/L、50umol/L、60umol/L、80umol/L進(jìn)行藥物干預(yù)，培養(yǎng)24、48小時后行MTT檢查，確定實(shí)驗(yàn)用姜黃素的濃度。分別應(yīng)用5氟尿嘧啶單獨(dú)或聯(lián)合姜黃素作為藥物組培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，分別培養(yǎng)24小時和48小時，行MTT檢查，了解5氟尿嘧啶單獨(dú)或聯(lián)合姜黃素對HepG2細(xì)胞生存率的影響，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，應(yīng)用RT-PCR方法檢測PTEN、AKT、TLR4mRNA的表

10、達(dá)，western-blot方法檢測PTEN、AKT蛋白的表達(dá)。第二部分:肝癌組織和肝硬化組織中PTEN、AKT、TLR4mRNA和PTEN、AKT蛋白表達(dá):取肝癌組織和肝纖維化組織各10例，western-blot法檢測PTEN、AKT蛋白的表達(dá)。提取肝癌組織和肝纖維化組織總RNA，RT-PCR方法檢測PTEN、AKT、TLR4mRNA的表達(dá)。
　　 結(jié)果:
　　 1、不同濃度姜黃素對HepG2細(xì)胞存活率的影響:

11、>　　 MTT結(jié)果顯示:在不同的時間點(diǎn)，不同濃度(5umol/L、l0umol/L、20umol/L、40umol/L、50umol/L、60umol/L、80umol/L)的姜黃素均對細(xì)胞有抑制作用，且呈明顯的時間和劑量依賴性。
　　 2、5-FU單用和聯(lián)合姜黃素對HepG2細(xì)胞存活率的影響:
　　 MTT結(jié)果顯示:在24、48小時兩個時間點(diǎn)，單獨(dú)使用5-FU(7.5umol/L)以及5-FU聯(lián)合姜黃素對HepG2細(xì)

12、胞均有抑制作用。且聯(lián)合用藥比單獨(dú)用藥抑制作用強(qiáng)，且干預(yù)時間愈久，抑制作用越強(qiáng)。
　　 3、5-FU單獨(dú)和聯(lián)合姜黃素對HepG2細(xì)胞中PTEN、AKT、TLR4的mRNA的影響:
　　 藥物干預(yù)HepG2細(xì)胞24小時，5-FU組較對照組PTEN和TLR4的mRNA表達(dá)明顯升高，AKTmRNA表達(dá)明顯降低;姜黃素聯(lián)合5-FU組較單用5-FU組PTEN和TLR4mRNA表達(dá)升高更加明顯，AKTmRNA表達(dá)下降亦更加顯著。與培養(yǎng)

13、24小時結(jié)果比較，藥物作用HepG2細(xì)胞48小時5-FU組PTEN和TLR4的mRNA的表達(dá)較24小時明顯升高，AKTmRNA表達(dá)較24小時明顯降低;姜黃素聯(lián)合5-FU組較單用5-FU組上述表達(dá)趨勢更加明顯。各指標(biāo)兩組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。
　　 4、5-FU單獨(dú)和聯(lián)合姜黃素對HepG2細(xì)胞中PTEN、AKT蛋白表達(dá)的影響:
　　 藥物干預(yù)HepG2細(xì)胞24小時，5-FU組較對照組PTEN蛋白表達(dá)升高，

14、AKT蛋白表達(dá)下降;姜黃素聯(lián)合5-FU組較單用5-FU組上述趨勢更加明顯。藥物干預(yù)48小時，5-FU單獨(dú)或是姜黃素聯(lián)合5-FU組PTEN蛋白升高和AKT蛋白下降較24小時趨勢更加明顯。各指標(biāo)兩組之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 5、肝癌組織和肝硬化組織中PTEN、AKT、TLR4mRNA和PTEN、AKT、P-AKT蛋白表達(dá):
　　 結(jié)果顯示肝癌組織中的PTEN、AKT、TLR4mRNA和PTEN、AKT、

15、P-AKT蛋白水平比肝硬化組織中上述指標(biāo)升高，各指標(biāo)兩組之間有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1、姜黃素可以促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，隨著濃度的增加和時間的延長促凋亡作用逐漸明顯。聯(lián)合5-FU的促凋亡作用更加明顯。
　　 2、姜黃素聯(lián)合5-FU通過PI3K/AKT信號通路降低了AKT的水平而提高了PTEN、TLR4的水平，從而提高了抗腫瘤的作用。
　　 3、在肝癌組織較肝硬化組織中PI3