內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡在遺傳性包涵體肌病病理機制中的作用.pdf

1、目的： 遺傳性包涵體肌病(HIBM)是一種常染色體隱性遺傳的遠端型肌病，由位于9p12-13的GNE基因發(fā)生突變引起；臨床上病變主要累及下肢遠端肌肉，疾病后期也可累及全身其他部位肌群，病情進展比較緩慢；主要病理特征為鑲邊空泡形成、肌核或肌漿內(nèi)管狀細絲包涵體及成群的肌纖維萎縮，很少發(fā)現(xiàn)肌纖維壞死和再生，這些顯著的病理學(xué)形態(tài)特征提示其有獨特的病理學(xué)意義，但其病原學(xué)和發(fā)病機制仍然未知。 有研究證實在包涵體內(nèi)有多種異常蛋白質(zhì)的表

2、達，包括Aβ(amyloid-β)、朊蛋白(prion)、泛素(ubiquiton)、tau蛋白等。2004年Vattemi發(fā)現(xiàn)散發(fā)性包涵體肌炎(s-IBM)患者的肌肉中存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)和非折疊蛋白反應(yīng)(UPR)；由于HIBM和s-IBM病理改變非常相似，只是后者伴有明顯的炎細胞浸潤，因此推測ERS和LJPR可能在HIBM病理機制中起重要作用。 2001年Yan C通過免疫組化和TUNEL方法發(fā)現(xiàn)在HIBM患者中存在凋亡現(xiàn)象，而

3、ERS又可以通過激活caspase-12誘導(dǎo)細胞凋亡，因此應(yīng)用免疫組化、免疫印跡方法探索異常蛋白質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與肌纖維凋亡過程之間的關(guān)系，從而探討HIBM的病理機制。 材料和方法： 選取山東大學(xué)齊魯醫(yī)院神經(jīng)肌肉病研究室接診的7例臨床和病理診斷為HIBM患者的肌肉標(biāo)本，一部分制成8μm冰凍切片，采用常規(guī)組織化學(xué)染色觀察HIBM患者的肌肉病理特點；一部分制成5μm冰凍切片，應(yīng)用原位TUNEL染色方法觀察HIBM患者肌纖維的凋

4、亡現(xiàn)象，并采用熒光免疫組織化學(xué)染色(IHC)檢測2種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白-BiP/GRP78和calnexin，以及2種凋亡蛋白-caspase-12和caspase-3在HIBM患者肌纖維中的表達情況，同時用雙重免疫熒光染色分析內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白和凋亡蛋白與肌纖維內(nèi)包涵物Aβ的關(guān)系；對染色顯示蛋白表達增高病人的冰凍肌肉標(biāo)本，采用免疫印跡技術(shù)(WB)進行半定量分析。TUNEL染色和IHC染色時選取3例DMD、3例PM及3例病理報告為正常的

5、肌肉標(biāo)本作為對照；WB分析時選取3例病理報告為正常的肌肉標(biāo)本作為對照。 結(jié)果： 1.常規(guī)組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)HIBM主要病理改變?yōu)榧±w維大小不等，萎縮纖維散在或成群分布，可見鑲邊空泡，內(nèi)核纖維增多，壞死和再生現(xiàn)象較輕微，肌間質(zhì)增生，無炎細胞浸潤。 2.TUNEL染色發(fā)現(xiàn)僅在HIBM組肌纖維中有數(shù)量不等的TUNEL陽性肌核，多位于外形正常肌纖維的肌膜下，中央核偶見陽性，鑲邊空泡內(nèi)未發(fā)現(xiàn)陽性肌核。 3.IHC染色

6、可見，在所有HIBM肌活檢中，70％～80％的空泡肌纖維含有大量邊界清楚，大小不一，呈斑片狀、點狀或長條狀的抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶抗體強陽性的包涵物，這些包涵物主要分布在肌纖維的非空泡肌漿部分，除此之外，在所有肌活檢中，10％～15％的非空泡纖維或其他外形正常的肌纖維也含有相同的包涵物；雙重免疫熒光染色可見，在所有異常肌纖維中，表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶BiP/GRP78陽性的包涵物內(nèi)同時可見Aβ表達，calnexin陽性肌纖維的連續(xù)切片上Aβ亦陽性

7、；WB分析發(fā)現(xiàn)BiP/GRP78(78-KD)在HIBM患者均有不同程度表達增加，而在正常肌肉中沒有；calnexin(90-KD)在不同患者增高程度不一，但均較對照肌肉明顯增加。 4.IHC證實凋亡通路信號蛋白caspase-12在部分肌纖維內(nèi)表達增加；凋亡執(zhí)行酶活性caspase-3未見表達增加，而部分肌纖維內(nèi)可見caspase-3表達增加；用雙重免疫熒光染色可見，在所有異常肌纖維中，表達caspase-3陽性的包涵物內(nèi)同時

8、可見Aβ表達：caspase-12陽性肌纖維的連續(xù)切片上Aβ亦陽性；WB分析顯示，caspase-12表達為約50-KD的前體蛋白和30～40-KD的裂解片段，HIBM組表達量較對照肌肉明顯增高；活性caspase-3的條帶未見出現(xiàn)，但caspase-3前體蛋白(35-KD)表達量較對照肌肉增高。 結(jié)論： 1.HIBM患者中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白BiP/GRP78和calnexin表達的增高，證實了在HIBM中存在ERS和

9、UPR。 2.原位TUNEL陽性表達、凋亡通路信號蛋白caspase-12及凋亡執(zhí)行酶caspase-3的表達增高均顯示HIBM患者肌纖維存在凋亡現(xiàn)象。 3.Aβ與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白、Aβ與凋亡蛋白同時表達提示異常折疊蛋白可能誘發(fā)ERS，后者通過激活caspase-12，從而激活caspase-3最終導(dǎo)致肌纖維發(fā)生部分凋亡，并形成鑲邊空泡，后者為HIBM的特征性病理改變。 意義： 1.本研究通過不同的方法