肝靶向乙型肝炎免疫球蛋白納米藥物的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、乙型肝炎(Hepatitis B，HB)是世界上最常見(jiàn)的傳染病之一。乙型肝炎免疫球蛋白(hepatitis B immunoglobulin，HBIG)是針對(duì)HBV的特異性被動(dòng)免疫制劑，早期研究認(rèn)為其治療作用是對(duì)血循環(huán)中包含HBsAg顆粒的高親和力結(jié)合及對(duì)HBV的中和作用。最近研究報(bào)道HBIG體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中能減少HBV的分泌或干擾包含HBV DNA中間體的核衣殼的包封，并可預(yù)防移植肝免受HBV再感染。 納米粒(nanoparti

2、cles，NP)是一類由天然或合成的高分子材料制成的粒徑在1 nm～1 000nm的固態(tài)膠體顆粒，在體內(nèi)易被巨噬細(xì)胞吞噬而集中分布在網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)豐富的肝、脾等部位，以納米粒作為載體制成的納米粒給藥系統(tǒng)具有靶向性、改變藥物體內(nèi)分布、控緩釋藥及提高藥物生物利用度等諸多優(yōu)點(diǎn)。 目的:基于HBIG的藥理作用與納米粒給藥系統(tǒng)的顯著優(yōu)點(diǎn)，選擇氰基丙烯酸正丁酯(butylcyanoacylate，BCA)為載體材料，探索乳化聚合法在較高pH值

3、條件下制備肝靶向乙型肝炎免疫球蛋白聚氰基丙烯酸正丁酯納米粒的工藝，研究肝靶向HBIG-PBCA-NP的肝靶向性與生物安全性，比較HBIG與HBIG-PBCA-NP對(duì)肝細(xì)胞的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用和對(duì)HBV感染細(xì)胞模型培養(yǎng)上清HBsAg、HBV DNA分泌抑制作用的差異變化，進(jìn)一步探討肝靶向給藥系統(tǒng)在乙型病毒性肝炎抗病毒治療中的應(yīng)用價(jià)值，為乙型肝炎的抗病毒治療提供新的思路和開(kāi)辟新的途徑。 方法： 1、HBIG抑制HBsAg、HBV

4、DNA分泌的體外實(shí)驗(yàn)研究：以含不同濃度HBIG的培養(yǎng)基培養(yǎng)QSG7701細(xì)胞，在不同的時(shí)間點(diǎn)取培養(yǎng)上清定量檢測(cè)的HBsAb，以透過(guò)率評(píng)價(jià)HBIG的體外跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用；以HepG2.2.15細(xì)胞為HBV感染細(xì)胞模型，在培養(yǎng)基中加入不同濃度的HBIG共培養(yǎng)數(shù)天，或先以一定濃度的HBIG共培養(yǎng)，第3天后更換為不含HBIG的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至第11天，分別于不同時(shí)間點(diǎn)收集培養(yǎng)上清定量檢測(cè)HBsAg、HBV DNA；定量檢測(cè)HBsAg和HBsAb采用

5、時(shí)間分辨免疫熒光分析法(time-resolved iminunofluorometric assay， IFMA)、HBV DNA采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法(real time fluorogenic quantitative poly-merase chain reaction，RTFQ-PCR)；用MTT法觀察藥物的細(xì)胞毒性。 2、肝靶向HBIG-PBCA-NP的制備工藝研究：選擇BCA為載體材料，用乳化聚合法在較高pH值條

6、件下制備HBIG-PBCA-NP，以HBIG-PBCA-NP的包封率、納米粒的外觀形態(tài)、多分散度、粒徑及其分布作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用多種單因素試驗(yàn)作初選，均勻設(shè)計(jì)和正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)作精選的方法，優(yōu)選出制備HBIG-PBCA-NP的最佳制備工藝。 3、肝靶向HBIG-PBCA-NP的肝靶向性研究：HBIG-PBCA-NP與HepG2.2.15細(xì)胞及QSG7701細(xì)胞共孵育，透射電鏡觀察細(xì)胞內(nèi)的納米粒；以含不同濃度HBIG-PBCA-NP的

7、培養(yǎng)基培養(yǎng)QSG7701細(xì)胞，選擇不同的時(shí)間點(diǎn)定量檢測(cè)培養(yǎng)上清的HBsAb，以透過(guò)率評(píng)價(jià)HBIG-PBCA-NP對(duì)肝細(xì)胞的通透性；以HBIG-PBCA-NP和/或HBIG尾靜脈注射昆明小鼠，透射電鏡觀察肝細(xì)胞內(nèi)的納米粒，免疫組織化學(xué)檢測(cè)肝組織HBIG的含量；采用Iodogen固相法制備<'125>I-HBIG；用優(yōu)選的HBIG-PBCA-NP制備工藝制備<'125>I-HBIG納米粒(<'125>I-HBIG-PBCA-NP)；尾靜脈注

8、射<'125>I-HBIG-PBCA-NP和<'125>I-HBIG后，在不同的時(shí)間點(diǎn)比較小鼠各組織和每克組織中的<'125>I放射性強(qiáng)度占總放射性強(qiáng)度的百分率，計(jì)算靶向指數(shù)，評(píng)價(jià)<'125>I-HBIG-PBCA-NP在各組織器官中的分布。 4、肝靶向HBIG-PBCA-NP的生物安全性研究：HBIG-PBCA-NP與HepG 2.2.15細(xì)胞及QSG7701細(xì)胞共孵育，光鏡及透射電鏡觀察細(xì)胞的病理變化；以HepG2.2.15

9、細(xì)胞、QSG7701細(xì)胞及外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)為細(xì)胞模型，用MTT法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)抑制率研究不同濃度的HBIG-PBCA-NP、HBIG和空白納米粒的細(xì)胞毒性，自動(dòng)生化儀檢測(cè)QSG7701細(xì)胞培養(yǎng)上清液LDH、ALT活性；以HBIG-PBCA-NP和/或HBIG尾靜脈注射昆明小鼠，透射電鏡、HE染色觀察觀察肝細(xì)胞的病理變化，自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清ALT變化；體外試管

10、法研究HBIG-PBCA-NP的溶血試驗(yàn)。 5、肝靶向HBIG-PBCA-NP抑制HBsAg、HBV DNA分泌的體外實(shí)驗(yàn)研究：與HBIG抑制HBsAg、HBV DNA分泌的體外實(shí)驗(yàn)研究方法相同。 結(jié)果 1、HBIG濃度為0.1、0,2、0.4 IU/ml與QSG7701細(xì)胞共孵育48h時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)約有38％～46％的HBIG。HBIG濃度為0.1 IU/ml～10.0IU/ml作用于第3、6、9天時(shí)能抑制Hep

11、G2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg、HBV DNA的分泌，濃度為0.01 IU/ml時(shí)無(wú)此作用。在無(wú)藥物繼續(xù)培養(yǎng)的第5、7天，培養(yǎng)上清HBsAg濃度較有藥物培養(yǎng)的第3天繼續(xù)下降，隨后(第9、11天)濃度逐步增高，到第11天時(shí)，與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性；培養(yǎng)上清HBV DNA水平在第5天時(shí)，較第3天繼續(xù)下降，第7、9、11天時(shí)逐步增高，與對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性。 2、優(yōu)選出乳化聚合法制備肝靶向HBIG-PBCA-NP的制備工

12、藝，按優(yōu)化工藝制備的HBIG-PBCA-NP，形態(tài)圓整、分散性好、光滑不粘連，多分散度較小，其平均粒徑為(119.87±8.01)nm，粒徑主要分布在50～220nm，藥物包封率(90.10±3.66)％。 3、在He，pG2.2.15細(xì)胞和QSG7701細(xì)胞的透射電鏡照片中胞漿和細(xì)胞核內(nèi)可見(jiàn)納米粒；不同濃度的HBIG-PBCA-NP與QSG7701細(xì)胞共孵育48h時(shí)，肝細(xì)胞內(nèi)約有65％～73％的HBIG，約是相同濃度HBIG的

13、1.5倍；昆明種小鼠肝組織透射電鏡照片中可見(jiàn)大量的納米粒；肝組織HBIG免疫組化結(jié)果表明相同濃度的HBIG-PBCA-NP組比HBIG組顯色更明顯；<'125>I-hBIG產(chǎn)品放射性濃度為1.82mci/7ml，放射比活度為152.25μci/mg HBIG；制備<'125>I-HBIG-PBCA-NP的平均粒徑為(123.85±7.61)nm，包封率為(86.3±5.1)％。<'125>I-HBIG和<'125>I-HBIG-PBCA

14、-NP尾靜脈注射小鼠各組織的放射性強(qiáng)度比較：在不同時(shí)間點(diǎn)<'125>I-HBIG-PBCA-NP在肝臟的放射性強(qiáng)度(CPM％)增加且放射性駐留時(shí)間更長(zhǎng)；HBIG納米粒組中每克肝組織的放射性強(qiáng)度百分率(CPM％/g)的分布最高，其次是脾臟；<'125>I-HBIG-PBCA-NP在肝臟、脾臟的靶向指數(shù)DTI均大于1，且肝臟大于脾臟。 4、光鏡及透射電鏡下HepG2.2.15細(xì)胞及QSG7701細(xì)胞無(wú)明顯病理改變；在所研究的濃度范圍

15、內(nèi)，HBIG、HBIG納米粒及空白納米粒對(duì)QSG7701細(xì)胞、HepG2.2.15細(xì)胞、PBMC的細(xì)胞毒性分級(jí)為0～1級(jí)，即無(wú)細(xì)胞毒性；各組不同濃度QSG7701細(xì)胞培養(yǎng)上清LDH、ALT值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；各濃度組HBIG、HBIG納米粒及空白納米粒的實(shí)驗(yàn)小鼠的肝組織電鏡照片及HE染色無(wú)明顯病理改變；各組血清ALT與對(duì)照組無(wú)差異；HBIG-PBCA-NP無(wú)溶血性。 5、HBIG-PBCA-NP濃度為0.1 IU/ml～10.0 I

16、U/ml作用于第3、6、9天時(shí)能抑制HepG2.2.15細(xì)胞培養(yǎng)上清HBsAg、IBV DNA的分泌，與對(duì)照組比較，差異有顯著性。但與相同濃度HBIG組比較無(wú)顯著性差異。在無(wú)藥物繼續(xù)培養(yǎng)的第5、7天，培養(yǎng)上清HBsAg濃度較有藥物培養(yǎng)的第3天繼續(xù)下降，隨后(第9、11天)逐步增高，第5～11天時(shí)與對(duì)照組比較，第9～11天時(shí)與同濃度HBIG組比較，差異有顯著性；培養(yǎng)上清HBV DNA水平第5天時(shí)，較第3天繼續(xù)下降，第7、9、11天時(shí)逐步增

17、高，第7天時(shí)0.1、1.0、5.0 IU/ml的納米粒組與對(duì)照組及同濃度的HBIG組比較，第9天時(shí)1.0、5.0 IU/ml的納米粒組與同濃度的HBIG組比較，第11天時(shí)5.0 IU/ml的納米粒組與同濃度的HBIG組比較，差異有顯著性。 結(jié)論 1、在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，HBIG能跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)入肝細(xì)胞內(nèi)，且HBIG能抑制HBsAg、HBV DNA的分泌。 2、在pH5.2條件下優(yōu)選出肝靶向HBIG納米粒的制備工藝，經(jīng)HB