G蛋白抑制肽GCIP對自發(fā)性高血壓大鼠心室重構影響及其藥物代謝動力學研究.pdf

1、高血壓病是遺傳和環(huán)境等多種因素所致的全球性常見病和多發(fā)病。近20多年來，隨著社會經濟狀況的改善和人民生活方式的轉變，高血壓的發(fā)病率呈逐年增加趨勢；如果高血壓長期不治療，會引起心、腦、腎等重要臟器的損害，如腦卒中，心肌梗死，充血性心衰及腎衰等。左室肥厚是高血壓主要的靶器官損害之一，可以引起心臟順應性以及收縮和舒張功能的下降，并最終導致心力衰竭的發(fā)生。心肌肥厚與重構是引起心血管疾病發(fā)生率和死亡率顯著升高的獨立的危險因素。心室重構特點為心肌細

2、胞肥大，間質纖維化及左室重量、形狀、結構及功能的改變。高血壓導致的左心室肥厚、心肌纖維化及冠脈結構異常即心室重構，是高血壓患者心血管事件發(fā)生與死亡的主要病理基礎。抗高血壓治療不僅應有效控制血壓，更應有效抑制和逆轉其心血管結構和功能異常，以減少心血管事件的發(fā)生率。 G蛋白在高血壓及心血管重構的形成發(fā)展過程中扮演著非常重要的角色，在多種因素誘發(fā)心肌肥大的細胞信號轉導過程中，G蛋白處于樞紐地位，針對G蛋白設計特異性阻止心肌肥大發(fā)生發(fā)展

3、的藥物可能具有更強的作用。GCIP(Gproteincompetitiveinhibitorypeptide)是由我室針對在心肌肥厚發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用的G蛋白α亞單位克隆制備出的一種G蛋白競爭性抑制肽，對體外培養(yǎng)的去甲腎上腺素誘導的大鼠心肌細胞肥大具有較好的抑制作用。GCIP-27是在GCIP基礎上經分子優(yōu)化制備出的一種GCIP的衍生肽，能夠抑制由AngⅡ、NE等誘導的心肌細胞的肥大和增生；在多種心肌肥厚模型上具有良好的抗心肌肥

4、大作用；并對自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneoushypertensiverat，SHR)的血管重構有良好的抑制作用。 本實驗以自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)為研究對象，采用多普勒超聲心動圖及無創(chuàng)尾套法，系統評價GCIP-27對SHR心室重構及血壓的影響；采用RT-PCR法從分子水平初步探究其抗心室重構的作用機制；并用同位素標記示蹤法觀察了GCIP-27在動物體內的分布、排泄、代謝過程，獲得藥代動力學參數，為其以后研發(fā)及應用奠定基

5、礎。 方法： 1.用SHR作為實驗動物模型，給予GCIP-27(10、30、90μg.kg-1，i.p.，bid)或氯沙坦(6mg.kg-1，ig，o.d.)治療8周，并設立Wistar大鼠正常對照。通過如下方法評價GCIP-27對大鼠心室重構及血壓的影響：①大鼠血壓的測定采用無創(chuàng)尾套法；②超聲心動圖評價大鼠的左心室結構和心功能：③心肥厚指數及心肌間質膠原含量的測定評價大鼠的心室肥厚程度；④HE染色，光鏡下觀察大鼠心肌組

6、織形態(tài)學改變；VG染色，對大鼠心肌膠原進行定性及半定量分析；透射電鏡觀察大鼠心肌細胞超微結構的改變。 2.采用RT-PCR法檢測大鼠心肌ANPmRNA、BNPmRNA、α-MHCmRNA、β-MHCmRNA的表達；放射免疫分析法測定心肌細胞磷脂酶C(PLC)活性。 3.采用同位素標記示蹤法，結合三氯乙酸(TCA)沉淀法及低分子量SDS-PAGE法，對GCIP-27進行了藥代動力學研究。 結果： 1.GCI

7、P-27對SHR血壓的影響SHR的收縮壓顯著高于正常組，10、30、90μg.kg-1的GCIP-27治療8周后均能明顯降低SHR的收縮壓(p＜0.01)，但其降壓效果遠不如6mg.kg-1的氯沙坦，90μg.kg-1的GCIP-27降壓效果僅為后者的60.6％。 2.GCIP-27對SHR心室重構的影響 (1)SHR模型組大鼠有明顯的心室重構現象，與正常組相比，模型組大鼠左室后壁厚度(PWT)、室間隔厚度(IVST)、

8、心肌肥厚指數(LVMI)、心肌膠原含量、心肌間質膠原面積(CA)、及膠原容積分數(CVF)明顯增高(p＜0.01)；經治療8周后，GCIP-27(10、30、90μg.kg-1)均能顯著減少(p＜0.05)大鼠的PWT、IVST、LVMI、CA、CVF及膠原含量；氯沙坦也能降低除LVMI之外的上述指標(p＜0.05)，但降低程度不及GCIP-27顯著。 (2)病理及電鏡： ①SHR模型組大鼠心肌組織形態(tài)及心肌細胞超微結構

9、嚴重受損，光鏡下可見心肌細胞明顯濁腫，空泡樣變化；細胞核肥大或固縮；細胞內容物成顆粒狀，斷裂融合；可見到壞死灶。VG染色可見模型組SHR大鼠心肌膠原分布較多。電鏡下可見心肌細胞腫大，核肥大、畸形、溶解等呈不規(guī)則變化；肌漿網擴張；線粒體增生明顯，排列紊亂，不同程度(輕、中、重)腫脹，內有空泡形成。 ②GCIP-27(90μg.kg-1)能明顯改善上述病理改變及心肌細胞超微結構，心肌組織形態(tài)及心肌細胞超微結構基本正常。 ③G

10、CIP-27(10、30μg.kg-1)和氯沙坦組大鼠心肌病理改變及超微結構有所改善，但改善不明顯，個別視野仍可見到壞死灶。 3.GCIP-27抗心室重構作用機制的研究 (1)SHR模型組大鼠心肌ANPmRNA、BNPmRNA、β-MHCmRNA的表達均顯著增加及α-MHCmRNA表達減少；治療8周后，GCIP-27(10、30、90μg.kg-1)及氯沙坦均能降低ANPmRNA、BNPmRNA、β-MHCmRNA的表達

11、及增加α-MHCmRNA的表達。 (2)模型組大鼠左心室心肌細胞PLC活性顯著增加(p＜0.01)；治療8周后，GCIP-27(10、30、90μg.kg-1)大鼠心肌細胞PLC活性顯著降低(p＜0.01)；氯沙坦也顯著降低SHR大鼠左室心肌細胞PLC活性(p＜0.01)，相當于GCIP-27低劑量(10μg.kg-1)的療效。 4.GCIP-27在動物體內的藥代動力學研究 (1)血藥濃度的測定血藥濃度-時間曲線

12、數據經DAS2.0藥代動力學統計程序擬合，求出有關藥代動力學參數為：在3.75-480ng.ml-1劑量范圍內，GCIP-27在小鼠體內按一級動力學代謝，并呈三室開放模型。靜注125Ⅰ-GCIP-2790μg·kg-1，電泳法和酸沉法測得t1/2α、t1/2β、t1/2γ分別為0.009h、0.245h、2.054h和0.025h、0.306h、2.323h；達峰時間tmax均為0.0333h，平均血漿清除率(cl)分別為0.295L·

13、h-1·kg-1、0.322L·h-1·kg-1，表觀分布容積(Vd)分別為0.559L·kg-1、1.29L·kg-1，體內平均滯留時間(MRT)分別為2.353h、2.515h。 (2)GCIP-27在小鼠體內的分布GCIP-27在小鼠體內分布廣泛，其中心、血管、腎、胃、肺、小腸等組織分布較高，肌肉、脂肪等組織相對較低，腦最低。 (3)GCIP-27在動物體內的排泄大鼠72h尿、糞、膽汁原形藥物排泄量分別為給藥量的2

14、6.13％，0.95％和4.12％，72h總排泄量為31.21％。小鼠72h尿、糞原形藥物排泄量分別為給藥量的27.92％，0.84％，72h總排泄量為28.76％。GCIP-27主要經尿液排泄，少量經膽汁排泄，少許經糞便排泄，提示腎是GCIP-27的主要排泄器官。 結論： 1.GCIP-27具有良好的抗SHR心室重構作用，及較明顯降低SHR血壓的效應，且呈劑量依賴關系。 2.GCIP-27改善心室重構作用明顯優(yōu)

15、于氯沙坦，90μg/kg的GCIP-27，劑量僅為氯沙坦(6mg/kg)的1/67，其降低大鼠的PWT、IVST、LVMI分別為氯沙坦的1.6倍、2.7倍、3.2倍；但其降壓效果僅為后者的60.6％。因此，GCIP-27改善心室重構的作用并非完全依賴于血壓的降低，而有較高的選擇性和特異性。 3.GCIP-27改善心室重構的作用機制與降低心肌細胞磷脂酶C(PLC)活性，以及抑制大鼠心肌ANPmRNA、BNPmRNA、β-MHCmR