轉座子介導的增強子捕獲技術在斑馬魚上初步應用.pdf

1、轉座子(Transposon，Tn)，存在于生物界的各種生物基因組中，是一段可以在基因組上自由移動并改變其位置的DNA序列。轉座子天然具有基因轉移特性，可作為基因載體用于基因組遺傳修飾。Sleeping Beauty(SB)、PiggyBac(PB)和Tol2等三種轉座子目前被廣泛應用于脊椎動物轉基因研究構建基因突變體庫，研究基因表達調控機理及表達特性。本研究利用自行構建的SB、PB和To12介導的增強子捕獲載體制備了增強子捕獲斑馬魚，

2、比較報告基因和捕獲的增強子及內源基因時空表達模式，以期獲得調控組織發(fā)育或細胞分化的特異性增強子。主要獲得以下研究結果:
　　1、根據(jù)不同熒光表型將SB、PB及To12介導的增強子捕獲轉基因斑馬魚F1代進行分類，選擇具有典型表達模式的個體建立7個品系，分別為SK-1、SK-3、SK-6、SK-12、TK-1、TK-4及PK-0。將7個品系分別與野生型交配產生F2代，觀察其胚胎早期不同發(fā)育階段綠色熒光蛋白表達模式，結果表明7個品系熒光

3、表型主要分為:腦、軀干、眼睛、心臟、下頜等。以F2代基因組為模板進行SP-PCR及測序結果表明，捕獲載體分別插入整合在基因組不同位點分布在5個不同染色體;共捕獲了7個不同的內源基因(slc9a8、ednraa、mettl22、wdr33、dlx1a、rps26和itgav)，其中4個插入位點位于內含子，1個位于外顯子，2個分別位于基因上游20Kb和下游10bp處。
　　2、利用內源基因反義RNA作為探針進行斑馬魚胚胎原位雜交，結果

4、表明在24hpf和48hpf兩個發(fā)育階段，內源基因與報告基因綠色熒光蛋白表達模式大體一致。腦、眼及全身等熒光信號強的組織其雜交后著色也較深。
　　綜上所述，本研究表明，三種轉座子介導的增強子捕獲載體均能有效應用于增強子捕獲。報告基因和內源基因可能在相同增強子調控下表達，綠色熒光信號基本可代表內源基因的時空表達特性。本研究可為增強子注解提供重要參考，為進一步研究增強子表達調控功能及基因活性奠定基礎，對后基因組時代的研究具有重要的意義