水稻大規(guī)模增強(qiáng)子捕獲系群體的創(chuàng)建與初步分析.pdf

1、水稻(Oryza sativa L.)是最重要的糧食作物之一,具有較小的基因組(430Mb),與其他禾本科植物的基因組具有良好的共線性,易于體外操作與分化,是研究單子葉植物基因組的模式植物.近年來(lái)水稻基因組研究取得了很大進(jìn)展,構(gòu)建了遺傳圖譜和物理圖譜,完成了秈稻和粳稻的全基因組草圖測(cè)序(Yu et al.,2002;Goffet al.,2002),2002年12月18日國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃工作組在東京宣布,國(guó)際水稻基因組測(cè)序計(jì)劃已圓

2、滿完成,共測(cè)定堿基對(duì)366,000kb,精確度達(dá)到99.99﹪,并預(yù)測(cè)遺傳基因62,435個(gè).在此基礎(chǔ)上,許多實(shí)驗(yàn)室開(kāi)始大規(guī)模地、系統(tǒng)地進(jìn)行水稻基因功能的研究.建立水稻突變體庫(kù)是功能基因組學(xué)研究的有效手段,而高效的水稻轉(zhuǎn)化體系是建立突變體庫(kù)的重要基礎(chǔ).該研究正是在建立起了高效水稻農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系基礎(chǔ)上,構(gòu)建了一個(gè)大規(guī)模的水稻增強(qiáng)子捕獲群體,并對(duì)其進(jìn)行了分子鑒定,初步建立起適合該群體的擴(kuò)增T-DNA側(cè)翼序列的PCR-walking技術(shù)體系,

3、已擴(kuò)增了部分突變體基因組中的T-DNA側(cè)翼序列,并對(duì)部分側(cè)翼序列進(jìn)行了測(cè)序分析.該研究是國(guó)家"863"計(jì)劃項(xiàng)目"水稻突變體庫(kù)的建立"的一部分,在這兩年的研究中,在與實(shí)驗(yàn)室全體人員的共同努力下,取得了以下幾個(gè)方面的進(jìn)展:1.在農(nóng)桿菌(Agrobacterium)介導(dǎo)的水稻轉(zhuǎn)化中,發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)后的愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)的時(shí)機(jī)對(duì)抗性愈傷組織產(chǎn)生和正常生長(zhǎng)有很大的影響,最佳的時(shí)機(jī)是在選擇培養(yǎng)10~15天后進(jìn)行繼代培養(yǎng),這樣90﹪以上的愈

4、傷組織可以產(chǎn)生能健康生長(zhǎng)的抗性愈傷組織;發(fā)現(xiàn)抗性愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上的繼代培養(yǎng)時(shí)間對(duì)后邊的分化效率有至關(guān)重要的影響,抗性愈傷組織繼代培養(yǎng)4~12天可以有比較高的分化率,超過(guò)16天或少于2天,分化率急劇降低.抗性愈傷組織在選擇培養(yǎng)基上培養(yǎng)8天時(shí),分化率最高,達(dá)到85﹪;在胚性愈傷的誘導(dǎo)、共培養(yǎng)侵染菌液的最佳濃度的確定、共培養(yǎng)的時(shí)間以及轉(zhuǎn)化不同階段的最適培養(yǎng)基類型等方面的研究分析基礎(chǔ)上,優(yōu)化建立起一套高效、操作性強(qiáng)、適合水稻粳稻品種日本晴

5、(O. sativa spp.Japonica)的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化方法體系.從愈傷組織誘導(dǎo)到得到水稻轉(zhuǎn)化體只需2.5月左右的時(shí)間.2.選用增強(qiáng)子捕獲質(zhì)粒(Enhancer-trapping vector)pFX-E24.2-15R,以粳稻日本晴為實(shí)驗(yàn)材料,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法,獲得了65,707個(gè)增強(qiáng)子捕獲T-DNA插入標(biāo)簽系.經(jīng)PCR和Southern雜交檢測(cè),表明95﹪以上的轉(zhuǎn)化體含有T-DNA插入片段.對(duì)T0代植株進(jìn)行了Southern

6、雜交分析,T-DNA插入片段的單拷貝的植株約占43﹪,平均拷貝數(shù)為1.7.3.對(duì)11,560株T0代水稻轉(zhuǎn)化植株抽穗期的葉和未成熟種子進(jìn)行了GUS組織化學(xué)染色,GUS基因在抽穗期種子部位和葉部的總表達(dá)率為27.23﹪,在葉部的表達(dá)率為10.07﹪,在胚的不同部位表達(dá)率為11.01﹪,在種皮的表達(dá)率為8.28﹪,在胚乳的表達(dá)率為3.42﹪.篩選出210個(gè)在這一生育期表達(dá)活性很強(qiáng)的增強(qiáng)子捕獲系,取樣并提取了DNA,以做進(jìn)一步的研究.4.用P