沙棘弗蘭克氏和非弗蘭克氏放線菌的分離、培養(yǎng)及分子鑒定.pdf

1、沙棘(Hippophae rhamnoides L.)屬胡頹子科沙棘屬植物，是我國北方半干旱地區(qū)的先鋒樹種，因其能與弗蘭克氏菌（Frankia）共生在根部形成固氮根瘤，能將大氣中分子態(tài)的氮還原成氨供植物吸收利用，能在瘠薄土壤和較惡劣的環(huán)境中生長，是改良土壤、治理水土流失、改善生態(tài)環(huán)境的優(yōu)良生態(tài)經(jīng)濟型樹種。并且，沙棘的果、葉和種子中含有大量的營養(yǎng)成分和對人體有重要意義的生物活性物質(zhì)。
　　為了更好的開發(fā)利用沙棘共生固氮特性，本論文對

2、沙棘根瘤弗蘭克氏菌的分離培養(yǎng)條件及其系統(tǒng)發(fā)育地位進行了初步的研究，主要的實驗結果如下：
　?。?）沙棘根瘤弗蘭克氏菌的系統(tǒng)發(fā)育地位。采集不同生態(tài)環(huán)境不同沙棘品種的根瘤，從根瘤內(nèi)直接擴增DNA，共得到39條根瘤內(nèi)生菌的16SrDNA序列，屬于20個單倍型，其中磴口沙棘根瘤內(nèi)生菌的16SrDNA序列有19條，屬于4個單倍型，孫吳的根瘤內(nèi)生菌的16SrDNA序列有20條，屬于16個單倍型，兩個地區(qū)間的根瘤內(nèi)生菌沒有共享的單倍型，不存在基

3、因交流?；诨驇熘邢螺d的和沙棘根瘤擴增的16SrDNA序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，將不同地域、不同宿主來源的弗蘭克氏菌分為4個明顯的分支，包括胡頹子侵染組、楊梅-木麻黃-赤楊侵染組、非典型菌株和未獲得純培養(yǎng)的根瘤弗蘭克氏菌組。其中來自沙棘根瘤的內(nèi)生菌以52％的支持率全部聚在了胡頹子侵染組，均屬于弗蘭克氏菌。
　　（2）沙棘根瘤內(nèi)生菌的分離、培養(yǎng)。實驗選取新鮮幼嫩的沙棘根瘤，采用BAP培養(yǎng)基和QMOD培養(yǎng)基，經(jīng)根瘤勻漿法和切片法從表面消毒

4、的根瘤中分離根瘤內(nèi)生菌，經(jīng)純化得到18個純培養(yǎng)菌株，其中通過切片法分離到14株，勻漿法得到4株。研究發(fā)現(xiàn)，根瘤切片法、BAP培養(yǎng)基及液體培養(yǎng)的方式更適合沙棘根瘤內(nèi)生菌的分離，液體培養(yǎng)能有效的分離菌株，菌落出現(xiàn)時間比固體分離早7-10天左右。
　?。?）沙棘根瘤純培養(yǎng)菌株的形態(tài)特征和分子鑒定。從沙棘根瘤中分離的18株純培養(yǎng)菌株除了JYY61、JYY62，其余都具有發(fā)達的氣生菌絲，在顯微鏡下所有菌株都有分支狀的菌絲，但沒有弗蘭克氏菌典

5、型的泡囊及孢子囊結構，均不屬于弗蘭克氏放線菌。根據(jù)基內(nèi)菌絲和氣生菌絲發(fā)育情況、菌絲與培養(yǎng)基結合程度、液體培養(yǎng)是否產(chǎn)生菌膜以及菌絲有無隔膜、孢子分化等形態(tài)培養(yǎng)特征，將來自沙棘根瘤的18個菌株分為兩類，并初步判定第一類菌株屬于諾卡氏菌屬（Nocardia），第二類菌株屬于小單孢菌屬（Micromonospora）?；诰W(wǎng)上下載和實驗得到的16SrDNA基因序列構建的系統(tǒng)發(fā)育樹（NJ樹和MP樹），18株非弗蘭克氏放線菌被分為明顯的兩個分支，分