陽離子磷酸膽堿聚合物負(fù)載siRNA抑制乙肝病毒復(fù)制的實驗研究.pdf

1、目的:
　　 (1)研究新型陽離子磷酸膽堿聚合物(MPC30DEA70)能否作為攜帶小干擾RNA(siRNA)的載體,并進一步研究其發(fā)揮的生物學(xué)效應(yīng)。
　　 (2)觀察該載體攜帶針對乙型肝炎病毒(HBV)X基因的siRNA在細(xì)胞水平能否抑制HBV的復(fù)制。
　　 方法:
　　 ①DAPI染核及四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法分析MPC30DEA70對HepG2.2.15的細(xì)胞毒性。
　　 ②設(shè)計熒光素

2、酶表達質(zhì)粒的小干擾(siLUC),以無熒光標(biāo)記的MPC30DEA70負(fù)載紅色熒光標(biāo)記的siLUC轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,24、48 h后熒光顯微鏡下拍照并計算在該細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染效率。
　　 ③在此基礎(chǔ)之上,檢測48 h時轉(zhuǎn)染細(xì)胞中的siLUC對熒光素酶基因表達的抑制效應(yīng)。
　　 ④用同法轉(zhuǎn)染針對HBV X基因的小干擾(siHBV X),RT-PCR法檢測48 h后HBV mRNA水平的變化,并分別于24、48、72

3、h后用ELASA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HBsAg,實時熒光定量RCR技術(shù)對HBV DNA進行定量檢測。
　　 結(jié)果:
　　 ①在本實驗設(shè)定的0.5、1、3、5 ug四個濃度下,MPC30DEA70對HepG2.2.15細(xì)胞的毒性較小,細(xì)胞存活率均在80％以上。
　　 ②MPC30DEA70負(fù)載siLUC在48 h的轉(zhuǎn)染效率可達到(52.33±2.0)％,而脂質(zhì)體負(fù)載的siLUC可達到(56.33±2.4)％。③4

4、8 h時轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞中的siLUC能夠有效抑制熒光素酶質(zhì)粒的表達。
　　 ③RT-PCR法證實48 h時以MPC30DEA70載體組siHBV X與內(nèi)參β-actin條帶灰度比值(1.14±0.1)與空白對照組(2.51±0.2)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義;與脂質(zhì)體組(0.85±0.1)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義;MPC30DEA70負(fù)載siHBV X能夠降低細(xì)胞上清液中HBsAg水平和HBV DNA的水平。72 h時檢測值

5、分別為(6.34±0.1)ng/ml和(4.00±0.3)×107 copics/ml,與空白細(xì)胞組的(22.86±1.5)ng/ml和(12.90±0.2)×107 copies/ml比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 (1)MPC30DEA70攜帶的siRNA能夠進入HepG2.2.15細(xì)胞中且有著較高的轉(zhuǎn)染效率;并發(fā)揮了一定的生物學(xué)效應(yīng),但抑制效果不及脂質(zhì)體組。
　　 (2)MPC30DEA70攜