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文檔簡(jiǎn)介
1、目的:
設(shè)計(jì)特異性結(jié)合乙肝病毒核心啟動(dòng)子的人工轉(zhuǎn)錄因子并觀察其對(duì)乙肝病毒轉(zhuǎn)錄的抑制作用。
方法:
1、利用Zine finger tools設(shè)計(jì)特異性靶向HBV核心啟動(dòng)子的鋅指蛋白,獲得鋅指蛋白的靶序列及氨基酸序列,并對(duì)該蛋白的理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析。
2、將ZFP氨基酸序列逆向翻譯成核苷酸序列并進(jìn)行優(yōu)化后人工合成。用帶有核定位信號(hào)(NLS)的引物擴(kuò)增ZFP片段并將其克隆至真核表達(dá)質(zhì)粒pcDN
2、A3.1(+),構(gòu)建pcDNA3.1(+)-ZFP,然后以此為基礎(chǔ)插入帶有Flag tag的KRAB序列,構(gòu)建人工轉(zhuǎn)錄因子的真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ATF。
3、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDN.A3.1(+)-ATF到COS-7細(xì)胞,應(yīng)用RT-PCR和Western Blot分別從mRNA水平和蛋白質(zhì)水平檢測(cè)ATF在真核細(xì)胞中的表達(dá)情況。
4、用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1(+)-ATF或pcDNA3.1
3、(+)分別轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞,ELISA和FQ-PCR檢測(cè)上清液中HBeAg和HBVDNA含量,RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)HBV mRNA表達(dá),免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)。
結(jié)果:
1、鋅指蛋白在HBV核心啟動(dòng)子上的靶序列為:
5’-AATGTCAACGACCGACCT-3’
2、鋅指蛋白的氨基酸序列為:
LEPGEKPYKCPECGKSFSTKNSLTEHQRTHTGEKPYKCPECGK
4、SFSQSGHLTEHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGNLVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDSGNLRVHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSDPGALVRHQRTHTGEKPYKCPECGKSFSTTGNLTVHQRTHTGKKTS
3、ZFP結(jié)構(gòu)特征分析為:等電點(diǎn)9.20,分子量19.69,穩(wěn)定指數(shù)為31.41,顯示為穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)提示該蛋白含有6段C2H2型鋅指單元序列,分別位于其
5、氨基酸殘基序列的第8~30、36~58、64~86、92-114、120-142及148~170位。同源建模也提示其含有6個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)。Structure Assessment對(duì)建模結(jié)果進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示空間結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。
4、pcDNA3.1(+)-ATF轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞后,經(jīng)RT-PCR及Western Blot檢測(cè),ATF mRNA和融合有Flag tag的ATF蛋白表達(dá)明顯增加,而轉(zhuǎn)染pcDNA3.1(+)的細(xì)胞內(nèi)則
6、沒有相應(yīng)的表達(dá),說明ATF在真核細(xì)胞內(nèi)是能夠正常表達(dá)的。
5、ATF重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入HepG2.2.15細(xì)胞后,細(xì)胞上清液中的HBVDNA和HBeAg含量明顯減少,細(xì)胞內(nèi)的HBV mRNA及HBcAg也顯著降低,說明ATF能夠有效抑制HBV的轉(zhuǎn)錄。
結(jié)論:
利用生物信息學(xué)方法設(shè)計(jì)了能特異性結(jié)合HBV核心啟動(dòng)子的鋅指蛋白,并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了完整的人工轉(zhuǎn)錄因子。實(shí)驗(yàn)證明設(shè)計(jì)的人工轉(zhuǎn)錄因子能夠在真核細(xì)胞內(nèi)正常表達(dá),
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