調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因SATB2的重要miRNAs的鑒定及功能研究.pdf

1、背景和目的：
　　 結(jié)直腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。臨床上有一半以上的結(jié)直腸癌患者在行根治性手術(shù)前已出現(xiàn)了微轉(zhuǎn)移，轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致CRC患者腫瘤復(fù)發(fā)和死亡的主要原因。因此，闡明結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，篩選和鑒定結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移中起重要作用的關(guān)鍵分子，對(duì)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移進(jìn)行預(yù)測(cè)、診斷和干預(yù)對(duì)提高結(jié)直腸癌治愈率、減少死亡率具有重要意義。
　　 腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)多步驟、

2、多階段、多途徑的復(fù)雜過(guò)程，每一階段都受到多種基因、蛋白質(zhì)或生物分子的調(diào)控，當(dāng)前多數(shù)研究專注于癌基因、抑癌基因、轉(zhuǎn)移抑制基因等相關(guān)基因在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中的作用和功能。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，除這些蛋白質(zhì)編碼基因能調(diào)節(jié)腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移外，還發(fā)現(xiàn)一些非編碼基因，如microRNA分子，也參與了腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程的調(diào)控。
　　 特定富含AT堿基DNA序列結(jié)合蛋白2(Special AT-rich sequence-bindingprotein2，SA

3、TB2)是一種重要的核基質(zhì)結(jié)合蛋白，可以通過(guò)與核基質(zhì)附著區(qū)(matrix attachment region，MAR)相結(jié)合，在染色體組裝及基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)SATB2在成人腦組織中高表達(dá)，在人胎腦中等表達(dá)，在成人肝臟、腎臟、骨髓及腦的特定區(qū)域包括杏仁核、胼胝體、尾狀核及海馬中較弱表達(dá)。SATB2的異常與人顱面畸形有關(guān)。SATB2功能的完全喪失可導(dǎo)致表達(dá)SATB2的顱面部間葉組織凋亡，并引起在人和小鼠顱面部

4、發(fā)育調(diào)節(jié)中起重要作用的Pax9、Alx4和Msx1等3個(gè)基因的表達(dá)模式發(fā)生改變。近年來(lái)，也有研究顯示SATB2在骨骼發(fā)育及成骨細(xì)胞分化、大腦皮層發(fā)育中起重要作用。
　　 本課題組前期研究證實(shí)SATB2蛋白在原發(fā)結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平與癌旁正常組織相比呈明顯下調(diào)趨勢(shì);SATB2蛋白的表達(dá)水平與腫瘤的侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及Duke's分期相關(guān)，隨著腫瘤的漸進(jìn)發(fā)展過(guò)程，SATB2的表達(dá)逐漸減弱;SATB2在結(jié)直腸癌中的低表達(dá)與

5、患者低生存率密切相關(guān)。迄今為止，在結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展中調(diào)節(jié)SATB2異常表達(dá)的關(guān)鍵因子尚不清楚，有待進(jìn)一步闡明。
　　 基因表達(dá)調(diào)控具有多個(gè)層次，轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)是關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。microRNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小分子RNA，長(zhǎng)約19-25個(gè)核苷酸，是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的重要轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子，可通過(guò)與靶基因mRNA的3'端非編碼區(qū)(3'untranslated region，3'URT)完全/不完全互補(bǔ)配對(duì)，抑制靶基因表達(dá)（負(fù)性調(diào)控

6、）。miRNA異常表達(dá)與腫瘤、發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。近十年來(lái)，“癌相關(guān)miRNA”已逐漸成為腫瘤發(fā)病機(jī)制探索熱點(diǎn)，miRNA可以通過(guò)以下幾個(gè)方面影響結(jié)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展:(1)直接作為癌基因或腫瘤抑制基因(2) miRNAs參與細(xì)胞信號(hào)通路調(diào)控腫瘤細(xì)胞遷移，侵襲，細(xì)胞增殖，EMT轉(zhuǎn)化，血管形成和凋亡等過(guò)程，影響結(jié)腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移。(3) miRNAs可作為腫瘤診斷和治療的標(biāo)志分子和生物靶點(diǎn)。
　　 目前，國(guó)內(nèi)外未見(jiàn)關(guān)于結(jié)直腸癌中靶向調(diào)

7、控SATB2的miRNAs報(bào)道，本研究旨在預(yù)測(cè)和鑒定靶向調(diào)SATB2基因miRNAs及其參與結(jié)直腸癌侵襲、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，從轉(zhuǎn)錄后層面揭示結(jié)直腸癌中SATB2基因異常表達(dá)的原因，從miRNA這個(gè)新的角度來(lái)理解腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的預(yù)防和治療提供新的策略。
　　 材料與方法：
　　 1、篩選靶向調(diào)控SATB2的候選miRNAs:
　　 利用TargetScan、Pictar和miRanda三個(gè)經(jīng)典

8、的miRNA靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)分析，結(jié)合前期miRNA芯片分析結(jié)果，共同篩選靶向調(diào)控SATB2基因結(jié)直腸的候選miRNAs。
　　 2、候選miRNA的表達(dá)檢測(cè):
　　 利用Real-time RT-PCR及原位雜交技術(shù)檢測(cè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系、組織及正常對(duì)照組織中候選miRNA的表達(dá)情況，分析miRNA和SATB2表達(dá)之間的關(guān)系及其臨床意義。
　　 3、候選miRNA在結(jié)直腸癌中的功能研究:
　　 3.1預(yù)測(cè)結(jié)

9、果的有效性:
　　 根據(jù)候選miRNAs預(yù)測(cè)結(jié)果，構(gòu)建SATB2基因3'UTR野生型和突變型的報(bào)告基因載體，結(jié)合miRNA模擬物、miRNA抑制物轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因檢測(cè)等技術(shù)手段，驗(yàn)證候選miRNA能否靶定調(diào)控SATB2基因表達(dá)，確定調(diào)控結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因SATB2的有效miRNAs。
　　 3.2 miRNA靶定抑制SATB2引起的腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的變化:
　　 建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miRNAs的CRC細(xì)胞，通過(guò)CC

10、K8、細(xì)胞周期、平板克隆實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞體外增殖能力的變化。用劃痕實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)和侵襲能力的變化;裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)、原位可視化移植瘤實(shí)驗(yàn)，從體內(nèi)水平觀察細(xì)胞的成瘤能力和轉(zhuǎn)移能力。繼而，以穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miRNA的細(xì)胞株為研究對(duì)象，觀察導(dǎo)入SATB2基因能否逆轉(zhuǎn)由miRNA過(guò)表達(dá)引起的細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。
　　 4、miRNA對(duì)細(xì)胞信號(hào)通路的影響:
　　 通過(guò)Western blot檢測(cè)EMT相關(guān)分子標(biāo)志物表達(dá)情況，

11、分析miRNA、靶蛋白SATB2和EMT之間關(guān)聯(lián)。
　　 5、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:
　　 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)和侵襲實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（means±SD）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）和LSD法，方差不齊時(shí)使用Welch法和Dunnett's T3法;兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)（Independent-Samples TTest）;結(jié)直腸配

12、對(duì)組織樣本RNA表達(dá)量檢測(cè)采用配對(duì)樣本T檢驗(yàn);雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期分析、動(dòng)物成瘤實(shí)驗(yàn)和CCK8實(shí)驗(yàn)主要采用析因分析，細(xì)胞組間差異采用方差分析，時(shí)間或階段差異分析采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、篩選候選miRNA:
　　 比對(duì)分析靶向調(diào)控SATB2基因的miRNAs生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果和前期SW480，M5細(xì)胞的miRNA差異表達(dá)譜結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-31、miR-2

13、7b和miR-182在M5細(xì)胞中表達(dá)水平明顯升高，并且均結(jié)合于SATB23'UTR的保守區(qū)。
　　 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-31和miR-182的抑制物后，M5和SW620細(xì)胞中SATB2表達(dá)增加(FSW480=35.164,PSW480=0.002; FDLD1=10.344,PDLD1=0.023),miR-31和miR-182的模擬后，SW480和DLD1細(xì)胞內(nèi)SATB2表達(dá)下降(FM5=29.298，PM5＜0.001;FSW6

14、20=24.165，PSW620＜0.001)，而導(dǎo)入miR-27b的模擬物和抑制物后，細(xì)胞內(nèi)SATB2表達(dá)變化不明顯(P＞0.05)。
　　 2、miR-31和miR-182的表達(dá):
　　 6株結(jié)直腸癌細(xì)胞株中，miR-31和miR-182表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=133.857，P＜0.001;F=13.929，P＜0.001)。轉(zhuǎn)移灶來(lái)源的細(xì)胞株中(SW480/M5、SW620和LoVo細(xì)胞)miR-31和miR

15、-182的表達(dá)量較高(t=-2.904，P=0.044;t=-4.498，P=0.011)。
　　 結(jié)直腸癌組織中miR-31和miR-182表達(dá)明顯高于配對(duì)正常組織(tmiR-31=-2.256，PmiR-31=0.038; tmiR-182=-3.907，PmiR-182=0.001)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織中二者表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的癌組織（tmiR-31=-2.904，PmiR-31=0.044; tmiR-182=

16、-4.498,PmiR-182=0.011)。
　　 3、miR-31和miR-182對(duì)CRC細(xì)胞生物學(xué)特性的影響建立穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-31的結(jié)直腸癌細(xì)胞株SW480/miR-31和DLD1/miR-31;穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-182的SW480/miR-182和DLD1/miR-182細(xì)胞株。
　　 CCK8增殖實(shí)驗(yàn):與對(duì)照細(xì)胞相比，SW480/miR-31和DLD1/miR-31細(xì)胞增殖能力明顯升高(FSW480=533

17、.400，PSW480＜0.001;FDLD1=369.533, PDLD1＜0.001);SW480/miR-182和DLD1/miR-182細(xì)胞增殖能力較高(F=538.553，PSW480＜0.001; FDLD1=238.913; PDLD1＜0.001)。
　　 平板克隆實(shí)驗(yàn):與對(duì)照細(xì)胞相比，SW480/miR-31和DLD1/miR-31細(xì)胞形成克隆較多（FSW480=302.890，PSW480＜0.001;FDL

18、D1=5.851，PDLD1＜0.001）;SW480/miR-182和DLD1/miR-182細(xì)胞形成較多克隆(FSW480=54.157，PSW480=0.001; FDLD1=21.752, PDLD1=0.002)。
　　 細(xì)胞周期檢測(cè):過(guò)表達(dá)miR-31后，停留在G0/G1期的CRC細(xì)胞減少（FSW480=16.389，PSW480=0.004;FDLD1=11.722，PDLD1=0.008），S期細(xì)胞增多（FSW4

19、80=21.125，PSW480=0.002; FDLD1=32.967，PDLD1=0.001）;過(guò)表達(dá)miR-182后，G0/G1期的CRC細(xì)胞減少(FSW480=47.257，PSW480＜0.001; FDLD1=24.915,PDLD1＜0.001)，S期細(xì)胞增多（FSW480=45.507，PSW480＜0.001;FDLD1=25.408，PDLD1＜0.001）。
　　 裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn):與對(duì)照組相比，SW480/m

20、iR-31和SW480/miR-182細(xì)胞皮下成瘤速度增快（FSW480/miR-31=12.381，PSW480/miR-182＜0.001;FSW480/miR-182=4.977，PSW480/miR-182＜0.001），Ki-67表達(dá)較高。
　　 體內(nèi)轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn):過(guò)表達(dá)miR-31和miR-182后，裸鼠發(fā)生腹腔轉(zhuǎn)移、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、肝轉(zhuǎn)移、肺轉(zhuǎn)移:而對(duì)照細(xì)胞組裸鼠的腹腔，淋巴結(jié)、肝臟和肺部均無(wú)轉(zhuǎn)移灶形成。
　　 4

21、、熒光素酶活性檢測(cè):
　　 構(gòu)建突變型SATB2基因3'UTR相關(guān)報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染miR-31可以降低細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性，抑制SATB2的表達(dá)(F=18.721，P＜0.001);轉(zhuǎn)染miR-182可以降低細(xì)胞內(nèi)熒光素酶的活性，抑制SATB2的表達(dá)(F=123.177，P＜0.001)。
　　 5、SATB2可逆轉(zhuǎn)miR-31和miR-182在CRC細(xì)胞中的作用CCK8實(shí)驗(yàn):轉(zhuǎn)染SATB2基

22、因后，SW480/miR-31和DLD1/miR-31細(xì)胞體外增殖能力下降(FSW480=255.452，PSW480＜0.001; FDLD1=1065.112，PDLD1＜0.001);SW480/miR-182和DLD1/miR-182細(xì)胞體外增殖能力下降(FSW480=1719.538, PSW480＜0.001; FDLD1=553.862, PDLD1＜0.001)。
　　 細(xì)胞周期:轉(zhuǎn)染SATB2基因后，停留在G1

23、/G0期的SW480/miR-31和DLD1/miR-31細(xì)胞增加（tSW480=-7.070，PSW480＜0.001;tDLD1=-4.041，PDLD1＜0.001），進(jìn)入S期細(xì)胞減少（tSW480=2.250，PSW480=0.002; tDLD1=6.257，PDLD1=0.003）;停留在G1/G0期的SW480/miR-182和DLD1/miR-182細(xì)胞G1/G0期細(xì)胞增加（tSW480=-18.160; PSW480＜

24、0.001;tDLD1=-6.156，PDLD1=0.004），S期細(xì)胞減少(tSW480=16.378,PSW480＜0.001;tDLD1=11.718,PDLD1＜0.001)。
　　 運(yùn)動(dòng)和遷移能力:轉(zhuǎn)染SATB2后，miR-31過(guò)表達(dá)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)遷移能力下降(tSW480=9.167,PSW480＜0.001; tDLD1=9.500,PDLD1＜0.001);miR-182過(guò)表達(dá)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力下降（tSW480=10.69

25、8，PSW480=0.003; tDLD1=10671，PDLD1＜0.001）。
　　 6、作用機(jī)制
　　 過(guò)表達(dá)miR-31和miR-182后，SW480和DLD1細(xì)胞由圓形，立方形向多分枝，長(zhǎng)梭形轉(zhuǎn)化，細(xì)胞中上皮標(biāo)志物E-Cadherin、β-Catenin表達(dá)下降，間葉標(biāo)志物N-Cadherin、Vimentin表達(dá)升高;導(dǎo)入SATB2可增加E-Cadherin表達(dá)，降低N-Cadherin、Vimentin表達(dá)

26、。
　　 miR-182過(guò)表達(dá)細(xì)胞內(nèi)TGF-β信號(hào)傳遞激活，Smad3蛋白質(zhì)表達(dá)增加;SPAK/JUK蛋白表達(dá)上調(diào)，MPAK通路激活;導(dǎo)入SATB2后，Smad3和SPAK/JUK表達(dá)降低。
　　 結(jié)論：
　　 1、miR-31和miR-182在結(jié)直腸癌中高表達(dá)與結(jié)直腸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及腫瘤Dukes'分期密切相關(guān)。miR-31或miR-182是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，過(guò)表達(dá)miR-31或

27、miR-182的結(jié)直腸癌患者預(yù)后不良。
　　 2、miR-31和miR-182均具有促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、克隆形成、侵襲、轉(zhuǎn)移的能力，在結(jié)直腸癌中具有促癌作用。
　　 3、miR-31和miR-182特異性與SATB2的3'UTR區(qū)結(jié)合，在結(jié)直腸癌細(xì)胞中負(fù)性調(diào)控SATB2的表達(dá)。
　　 4、miR-31通過(guò)抑制SATB2的表達(dá)、誘導(dǎo)EMT形成，促進(jìn)結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移。
　　 5、miR-182通過(guò)抑制SAT