基于微流控系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞侵襲力分析及相關(guān)藥物篩選.pdf

1、前言
　　 轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的重要生物學(xué)行為之一,也是影響腫瘤患者預(yù)后并導(dǎo)致治療失敗的主要因素。轉(zhuǎn)移是發(fā)生在腫瘤宿主內(nèi)一系列復(fù)雜過(guò)程的最終結(jié)果,其中腫瘤侵襲細(xì)胞外基質(zhì)是轉(zhuǎn)移形成中多個(gè)步驟中最關(guān)鍵的一步,是轉(zhuǎn)移的前奏[1,2]。建立能夠模擬腫瘤侵襲力的檢測(cè)分析方法對(duì)認(rèn)識(shí)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制,進(jìn)行相關(guān)藥物篩選具有重要意義。早期發(fā)展的檢測(cè)侵襲力的方法主要利用含有基底膜的各種天然組織作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?在此基礎(chǔ)上,Albini[1]等人將人工基質(zhì)膠

2、包被于帶有微孔的膜上,構(gòu)建了腫瘤細(xì)胞侵襲力分析的體外模型,稱為勃頓小室法(Boydenchamber)或Transwell小室法。該模型是目前腫瘤細(xì)胞生物學(xué)研究和抗腫瘤藥物篩選中應(yīng)用最為廣泛的方法,培養(yǎng)小室已被商品化。但該方法的檢測(cè)過(guò)程包含多個(gè)手工操作步驟,易造成檢測(cè)誤差,難以準(zhǔn)確定量細(xì)胞數(shù)量,同時(shí)也不適合對(duì)細(xì)胞侵襲行為進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察和監(jiān)測(cè)。
　　 微流控芯片技術(shù)是一種新的微型分析系統(tǒng),利用微加工技術(shù)可以在厘米大小的芯片上刻蝕出微

3、米尺寸的反應(yīng)管道,微型化的結(jié)構(gòu)尺寸更利于模擬生物體內(nèi)環(huán)境以進(jìn)行細(xì)胞的相關(guān)分析,此外,微流控芯片還具有對(duì)多個(gè)分析過(guò)程進(jìn)行自動(dòng)化、集成化控制的優(yōu)勢(shì),進(jìn)而可以提高整個(gè)分析過(guò)程的準(zhǔn)確性和速度。本研究擬建立基于微流控的腫瘤細(xì)胞侵襲力分析系統(tǒng),定量評(píng)價(jià)細(xì)胞的侵襲能力,并與圣誕樹形梯度發(fā)生器集成,利用二者形成的垂直方向和水平方向的雙向梯度,進(jìn)行抗腫瘤侵襲藥物的篩選。
　　 實(shí)驗(yàn)材料及方法
　　 芯片的基本設(shè)計(jì)思想是在完成細(xì)胞侵襲力分析

4、的同時(shí)實(shí)現(xiàn)相關(guān)藥物的篩選。芯片結(jié)構(gòu)包括供細(xì)胞侵襲力分析的三條基本通道即細(xì)胞通道、基質(zhì)膠通道和條件培養(yǎng)基通道,以及供藥物篩選的圣誕樹型梯度發(fā)生器。通過(guò)流體控制在細(xì)胞通道-基質(zhì)膠通道-條件培養(yǎng)基通道之間形成細(xì)胞遷移所需的垂直方向濃度梯度。通過(guò)與樹狀梯度生成器的連接可在細(xì)胞通道形成水平方向的藥物濃度梯度用來(lái)進(jìn)行抗侵襲藥物篩選。
　　 選用AZ-P4620正光刻膠軟光刻法制作陽(yáng)模,再將PDMS預(yù)聚物和固化劑以10:1(m/m)的比例混合

5、均勻,澆灌在陽(yáng)模上。抽真空30min除氣,然后在85℃的烘箱中,固化30min,將PDMS從陽(yáng)模板上剝離,等離子體處理后與玻璃進(jìn)行封接,即可完成芯片制作。
　　 對(duì)芯片進(jìn)行一定處理后,在基質(zhì)膠通道內(nèi)注入膠原,37℃固化2小時(shí)后,真空除氣通入不同的液體。首先對(duì)芯片內(nèi)濃度梯度形成條件進(jìn)行優(yōu)化,即在樹狀梯度生成區(qū)的兩個(gè)入口分別通入藍(lán)色和紅色染料,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入透明水溶液,觀察和記錄芯片內(nèi)梯度形成;在優(yōu)化的梯度形成條件下進(jìn)行細(xì)胞

6、培養(yǎng),取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的不同細(xì)胞,胰酶消化后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/mL注入芯片細(xì)胞通道,在樹狀梯度生成區(qū)的兩個(gè)入口均通入含10%血清培養(yǎng)基,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基,連續(xù)觀察并記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài);應(yīng)用優(yōu)化的芯片內(nèi)細(xì)胞培養(yǎng)條件,進(jìn)行細(xì)胞侵襲力的分析檢測(cè),即在樹狀梯度生成區(qū)兩入口均通入無(wú)血清培養(yǎng)基,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基以形成垂直方向的梯度。連續(xù)觀察細(xì)胞侵入基質(zhì)膠的情況,并采用軟件計(jì)算細(xì)胞侵襲面積及前

7、導(dǎo)細(xì)胞遷移距離,定量評(píng)價(jià)細(xì)胞侵襲能力;為驗(yàn)證系統(tǒng)功能,在樹狀梯度生成區(qū)的兩個(gè)入口分別通入含10%血清培養(yǎng)基和無(wú)血清培養(yǎng)基,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基,在樹狀梯度生成區(qū)域產(chǎn)生水平方向的0～10%的血清梯度,并與條件培養(yǎng)基通道內(nèi)含10%血清的培養(yǎng)基形成垂直方向的梯度,觀察細(xì)胞在雙向血清梯度條件下的侵襲情況;取抗腫瘤藥物十字胞堿,用無(wú)血清培養(yǎng)基配制成0.2μM濃度,將含有藥物的培養(yǎng)基溶液和正常無(wú)血清培養(yǎng)基注入樹狀濃度梯度生成區(qū)

8、域,在芯片內(nèi)形成沿細(xì)胞通道方向分布的連續(xù)藥物濃度梯度;取高侵襲性SGC-7901細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞注入細(xì)胞通道,在條件培養(yǎng)基通道內(nèi)注入含10%血清的培養(yǎng)基,形成垂直方向的血清梯度,連續(xù)觀察藥物作用下,芯片水平方向不同位置細(xì)胞侵入基質(zhì)膠的情況,并通過(guò)測(cè)量侵襲面積和前導(dǎo)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)距離進(jìn)行定量評(píng)價(jià)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　 一、芯片的制作與濃度梯度形成
　　 采用光刻法成功制作PDMS芯片。優(yōu)化芯片內(nèi)濃度梯度形

9、成條件,結(jié)果顯示,在不同流速下考察芯片內(nèi)的梯度形成狀況。在Q=3μL/hr流速下,能夠快速形成實(shí)驗(yàn)所需的雙向濃度梯度,且能夠長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定維持。
　　 二、芯片內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)
　　 實(shí)驗(yàn)采用多種細(xì)胞系進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng),結(jié)果表明包括正常和腫瘤細(xì)胞的多種不同細(xì)胞在芯片內(nèi)均能正常生長(zhǎng)并增殖。證實(shí)了芯片的細(xì)胞培養(yǎng)能力。
　　 三、芯片內(nèi)的細(xì)胞侵襲力檢測(cè)及定量分析
　　 采用具有不同侵襲能力細(xì)胞系進(jìn)行芯片侵襲力檢測(cè),分別為

10、無(wú)侵襲性的人胚腎細(xì)胞系HEK-293、中低侵襲性腸癌細(xì)胞系SW-480、中低侵襲性乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、中侵襲性宮頸癌細(xì)胞系HeLa、高侵襲性胃癌細(xì)胞系SGC-7901。結(jié)果顯示,腫瘤細(xì)胞均不同程度進(jìn)入基質(zhì)膠通道,其中高侵襲胃癌細(xì)胞系SGC-7901運(yùn)動(dòng)現(xiàn)象最為明顯,甚至有細(xì)胞進(jìn)入到條件培養(yǎng)基通道,中低侵襲細(xì)胞系運(yùn)動(dòng)進(jìn)入基質(zhì)膠通道但并未進(jìn)入條件培養(yǎng)基通道,且不同細(xì)胞系之間存在一定差別。通過(guò)連續(xù)的觀察,可以看到各種具有不同侵襲能力的細(xì)胞

11、系每天的運(yùn)動(dòng)變化情況。證實(shí)了該芯片系統(tǒng)能夠應(yīng)用于不同細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)檢測(cè)以及同種細(xì)胞在不同作用下的運(yùn)動(dòng)變化檢測(cè)。
　　 實(shí)驗(yàn)結(jié)果通過(guò)測(cè)量侵襲面積和前導(dǎo)細(xì)胞侵襲距離的方法進(jìn)行了定量分析。兩種方法的分析結(jié)果基本一致,能夠顯示出高、中、低侵襲性細(xì)胞系之間的差異。
　　 四、采用芯片系統(tǒng)進(jìn)行抗侵襲藥物的篩選
　　 為了對(duì)系統(tǒng)功能性進(jìn)行檢測(cè)考查系統(tǒng)是否可以形成垂直方向和水平方向的雙向血清梯度,實(shí)驗(yàn)使用高侵襲細(xì)胞系SGC-79

12、01細(xì)胞作為模式細(xì)胞。在細(xì)胞通道內(nèi)使用無(wú)血清和含10%血清的培養(yǎng)基形成水平方向的濃度梯度,并與條件培養(yǎng)基通道內(nèi)的含10%的培養(yǎng)基形成垂直方向的濃度梯度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,沿芯片水平方向侵入基質(zhì)膠通道的細(xì)胞逐漸減少,說(shuō)明該系統(tǒng)在水平方向及垂直方向均可形成功能性梯度。
　　 藥物篩選實(shí)驗(yàn)部分,選用0～0.2μM十字胞堿藥物梯度分別作用SGC-7901細(xì)胞和MDA-MB-231細(xì)胞。對(duì)SGC-7901細(xì)胞結(jié)果進(jìn)行分析,顯示隨著藥物濃度的增

13、加,細(xì)胞的侵襲運(yùn)動(dòng)受到不同程度的抑制,且該抑制作用與藥物的濃度呈現(xiàn)正相關(guān),并表現(xiàn)出明顯的藥物濃度依賴性,即該系統(tǒng)可定量篩選和評(píng)價(jià)藥物的抗侵襲能力。對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的作用結(jié)果同樣可以檢測(cè)出隨藥物濃度的增加細(xì)胞的侵襲逐漸受到抑制,此外,通過(guò)熒光染色可同時(shí)觀察到藥物具有的誘導(dǎo)凋亡作用。
　　 結(jié)論
　　 本研究建立了基于微流控的腫瘤細(xì)胞侵襲力分析系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)了對(duì)不同侵襲能力腫瘤細(xì)胞的定量分析:通過(guò)建立雙向、連續(xù)濃度梯度