草魚白細胞介素1β誘導表達的負調(diào)控機制及其在炎癥反應中的意義.pdf

1、白細胞介素lβ(IL-lβ)是IL-1家族中最重要的成員之一。大量的研究表明，作為一種重要的促炎癥因子IL-lβ在炎癥和疼痛的發(fā)生、自身免疫疾病、先天和獲得性免疫反應中都發(fā)揮著重要的作用。特別是在炎癥反應中IL-lβ的誘導表達及調(diào)控機制在控制炎癥反應強度和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著決定性的作用。
　　魚類IL-lβ在基因定位、蛋白結構和分泌機制方面與哺乳動物同系物既有相似性也存在較大差異，但是目前對于魚類IL-lβ誘導表達的調(diào)控機制仍

2、然缺乏清楚的認識。在本論文中以草魚為研究模型，在分析炎癥條件和重組草魚IL-lβ誘導IL-lβ表達的特征基礎上，證明IL-lβ受體II（IL-1RII）和抑炎癥因子（TGF-β1）參與了草魚IL-lβ誘導表達的負調(diào)控過程，并闡明了相關分子機制。研究內(nèi)容如下：
　　1.炎癥條件下草魚IL-1β的誘導表達：（1）通過同源克隆技術獲得草魚IL-1β的cDNA全序列，再采用生物信息學方法分析所得基因。（2）通過熒光定量PCR（qPCR）技

3、術發(fā)現(xiàn)草魚 IL-1β在草魚頭腎、肝、腎、胸腺、脾等免疫器官中表達量較高，證明草魚IL-1β發(fā)揮免疫功能的場所十分保守。（3）在細菌脂多糖（LPS）刺激草魚頭腎白細胞（HKL）的體外模型中，發(fā)現(xiàn) LPS可以迅速地誘導 IL-1β的高表達但誘導表達強度隨著時間降低。（4）在嗜水氣單胞菌活體感染草魚的體內(nèi)模型中，發(fā)現(xiàn)感染后IL-1β的誘導表達迅速上升，但隨后又下降。體外體內(nèi)的實驗都表明在炎癥反應條件下草魚IL-1β的誘導表達呈現(xiàn)快速和瞬時的

4、特征。
　　2.草魚 IL-1β的自我誘導表達：（1）通過重組表達和純化獲得了高純度重組草魚IL-1β蛋白，通過qPCR和檢測細胞活力的CCK8實驗證明該重組蛋白具有生物學活性。（2）以重組草魚IL-1β蛋白為抗原委托制備多克隆抗體，通過免疫印跡（WB）實驗證明所獲多克隆抗體能夠特異識別草魚IL-1β蛋白。（3）在重組草魚IL-1β蛋白刺激HKL后，發(fā)現(xiàn)重組IL-1β在1小時內(nèi)即可誘導自身表達，隨后誘導表達倍數(shù)迅速降低，其細胞信號

5、傳導機制包括MAPK和NFκB信號通路。
　　3.草魚IL-1受體 II（IL-1RII）的分離鑒定及其對 IL-1β誘導表達的負調(diào)控作用：（1）通過同源克隆技術分離了草魚IL-1RII的cDNA全序列，生物信息學方法揭示了所得基因與其它物種同源基因之間的進化關系。（2）采用qPCR檢測發(fā)現(xiàn)草魚IL-1RII在肝、脾、頭腎和鰓組織中表達量較高。（3）在炎癥反應條件下，草魚IL-1RII在體內(nèi)和體外模型中均可被誘導表達，而對照組的I

6、L-1RII基因表達水平均無變化，表明IL-1RII的誘導表達對于炎癥刺激的依賴性。（4）在重組草魚IL-1β蛋白刺激HKL的細胞模型中，重組草魚IL-1β可以通過MAPK和NFκB信號通路誘導草魚IL-1RII的表達。（5）通過重組表達、親和和分子篩層析分離純化獲得了高純度重組草魚IL-1RII的胞外區(qū)蛋白?；贓LISA的蛋白結合實驗證明重組草魚IL-1RII胞外區(qū)蛋白可以在體外與重組草魚IL-1β相結合。（6）重組草魚IL-1RI

7、I可以在體外顯著抑制重組草魚IL-1β對自身基因的誘導表達。這些實驗結果證明在炎癥反應或草魚IL-1β刺激下產(chǎn)生的草魚IL-1RII可能是負調(diào)控草魚IL-1β表達的機制之一。
　　4.草魚抑炎癥因子對IL-1β誘導表達的負調(diào)控作用：（1）不論在嗜水氣單胞菌感染的體內(nèi)模型還是LPS刺激HKL的體外模型中，草魚抑炎癥因子TGF-β1均被誘導高表達，而對照組的TGF-β1基因表達水平均無變化，表明TGF-β1可能參與了炎癥反應的調(diào)節(jié)。（

8、2）在草魚HKL中發(fā)現(xiàn)重組草魚IL-1β蛋白可以通過MAPK和NFκB信號通路誘導TGF-β1基因的表達,提示TGF-β1可能以反饋方式參與IL-1β的調(diào)節(jié)作用。（3）草魚TGF-β1的抗體中和實驗發(fā)現(xiàn)草魚TGF-β1抗體可以延長IL-1β對自身誘導表達的作用時間，證明內(nèi)源性的TGF-β1參與了草魚IL-1β的自我誘導作用。（4）上述結論被以下實驗結果證實：草魚HKL中重組草魚TGF-β1可以抑制重組草魚IL-1β的自我誘導表達作用。（

9、5）在機制方面, WB分析證明重組草魚TGF-β1可以通過抑制IκB的磷酸化來影響NFκB信號通路的激活，從而降低重組草魚IL-1β對自身基因的誘導表達作用。（6）同時,重組草魚TGF-β1可以在體外抑制重組草魚IL-1β對其受體相關基因（IL-1RI和IL-1RAcP）的誘導表達作用。相反，重組草魚TGF-β1刺激對IL-1β信號具有抑制作用的IL-1RII的表達，并放大重組草魚IL-1β對IL-1RII的誘導表達作用。因此,重組草魚

10、TGF-β1在抑制IL-1β信號放大相關基因（IL-1RI和IL-1RAcP）表達的同時又能增強IL-1β信號內(nèi)源天然拮抗劑（IL-1RII）的表達，從而雙重有利于TGF-β1抑制IL-1β信號的作用。（7）另一方面，qPCR和WB實驗發(fā)現(xiàn)重組草魚IL-1β可以上調(diào)TGF-β1的I型受體（ALK5）的表達，并能放大重組草魚TGF-β1對ALK5的誘導表達作用。此外，重組草魚IL-1β可以增強重組草魚TGF-β1引起的Smad2磷酸化水平

11、，證明IL-1β可以放大TGF-β1的信號傳導。（8）在嗜水氣單胞菌感染的體內(nèi)模型中發(fā)現(xiàn)重組TGF-β1可以抑制細菌感染對草魚IL-1β的誘導表達作用，證明了重組TGF-β1在體內(nèi)的抑炎癥功能。這些實驗結果證明草魚TGF-β1通過影響IL-1β受體相關基因（IL-1RI、IL-1RAcP和IL-1RII）的表達和細胞信號通路（NFκB）的激活來抑制草魚IL-1β對自身基因的誘導表達；反之, IL-1β可以放大TGF-β1的信號傳導。因此

12、，IL-1β和TGF-β1的相互作用構成了草魚IL-1β誘導表達的負調(diào)控機制之一。
　　總之，本論文在明確草魚IL-1β的兩種誘導表達（炎癥誘導和自我誘導）方式的基礎上，分別揭示了基于內(nèi)源天然拮抗劑（IL-RII）和抑炎癥因子（TGF-β1）負調(diào)節(jié)IL-1β誘導表達的方式和原理，從而詮釋了在魚類基于IL-1β信號引起的炎癥反應放大過程中的控制機制。本論文的發(fā)現(xiàn)不僅揭示了魚類維持免疫穩(wěn)態(tài)的兩種重要分子機制，而且有利于了解先天性免疫系