Fox03a在軟脂酸誘導肝細胞凋亡中的作用及其機制的研究.pdf

1、研究背景：
　　 非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝應激相關(guān)性肝病，包括單純性脂肪肝(simpiesteatosis，SS)、脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis，NASH)和肝硬化。NAFLD是構(gòu)成代謝綜合征(metabolic syndrome，MS)的主要條件，它可以是一個獨立的疾病，但更多見的還是全身性疾患在

2、肝臟的病理過程。NAFLD發(fā)病率逐年上升，發(fā)病年齡也日趨年輕化，其預后不再是單一的良性經(jīng)過，很有可能發(fā)展為肝硬化、肝癌甚至相關(guān)死亡。NAFLD發(fā)病機制復雜，目前尚未十分清楚，普遍為人們所接受的是“二次打擊”假說，但不能解釋NAFLD發(fā)生發(fā)展過程中的所有問題，近年研究也表明，約10～20％的NAFLD患者無胰島素抵抗(insulin resistance，IR)，約50％的NAFLD未完全符合MS的診斷標準，那么我們推測，NAFLD的形成

3、和發(fā)展可能有更多次的打擊或還有未知的啟動因素。根據(jù)不同原因?qū)е碌母渭毎麚p傷，都源于肝細胞的死亡，而肝細胞死亡基礎(chǔ)為壞死與凋亡二種模式，業(yè)已證明，在非酒精性脂肪肝患者中，其Fas表達和肝細胞的凋亡是增加的。最新研究發(fā)現(xiàn)，不飽和脂肪酸(尤其是多不飽和脂肪酸)對肝臟有保護作用，而飽和脂肪酸對肝臟有毒性作用。NAFLD患者體內(nèi)，軟脂酸是含量最多的一種飽和脂肪酸。結(jié)合近年在腫瘤形成和免疫調(diào)節(jié)等領(lǐng)域研究發(fā)現(xiàn)：FoxO(Forkhead box-co

4、ntaining protein，class O)轉(zhuǎn)錄因子在細胞周期、新陳代謝、DNA修復、細胞凋亡、抵抗氧化應激、長壽等方面發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。其家族成員FoxO3a有促進靶基因如FasL，Bim、p130和Cdkn1b/p27的表達，導致細胞凋亡。當被激酶磷酸化后，F(xiàn)oxO3a就轉(zhuǎn)出細胞核，進入胞漿，與蛋白14-3-3結(jié)合，失去促凋亡活性，而得以肯定。因此，我們推測肝細胞軟脂酸的堆積和FoxO3a參與調(diào)控細胞凋亡可能是NAFLD的重

5、要發(fā)病機制。
　　 基于上述學術(shù)假設(shè)，結(jié)合我們近年有關(guān)脂肪肝發(fā)病機理研究所獲的信息，本研究從以下三個部分漸次深入地探討NAFLD細胞死亡的細胞與生物學基礎(chǔ)，相關(guān)問題的闡明可望為揭示NAFLD的發(fā)病機制，為病情進展的干預和并發(fā)癥的預防提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 一、軟脂酸誘導肝細胞內(nèi)脂肪沉積和對肝細胞凋亡的影響
　　 1、構(gòu)建細胞模型：選擇人肝癌細胞株HepG2.2.15細胞和L02細胞作為研究對象

6、，通過軟脂酸誘導肝細胞發(fā)生脂肪變性，檢測細胞內(nèi)TG(甘油三酯)含量及油紅O染色鑒定細胞模型構(gòu)建成功與否。
　　 2、細胞分組：不同濃度的軟脂酸(100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L、600μmol/L)培養(yǎng)24h和400μmol/L軟脂酸培養(yǎng)6、12、24、48h。
　　 3、采用MTT法、Vexinv-FITC/PI雙染流式細胞術(shù)和Caspase3檢測試劑盒，觀察HepG2.2.15細胞、L02細

7、胞的存活率、凋亡率及Caspase3活性。
　　 4、RT-PCR檢測HepG2.2.15細胞的Bim mRN.A、p27kip1 mRNA；Western Blot方法檢測總FoxO3a和p-FoxO3a(Thr32)蛋白。
　　 二、FoxO3asiRNA1在軟脂酸誘導HepG2.2.15細胞凋亡中的作用
　　 1、FoxO3a小干擾RNA的篩選
　　 ①引物合成：根據(jù)人FoxO3a的基因序列，設(shè)計并

8、化學合成3條siRNA引物(P1，P2，P3)及隨機陰性對照(siRNA-NC)。
　　 ②細胞轉(zhuǎn)染：將siRNA-NC-FAM轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細胞，通過倒置熒光顯微鏡篩選siRNA的轉(zhuǎn)染濃度。
　　 ③RT-PCR方法：檢測FoxO3a mRNA的表達，篩選最有效靶向FoxO3a的siRNA的序列。
　　 ④Western Blot方法：驗證轉(zhuǎn)染抑制效果最好序列的細胞的FoxO3a蛋白的表達。
　

9、　 2、軟脂酸與轉(zhuǎn)染FoxO3a siRNA1的HepG2.2.15細胞的培養(yǎng)
　　 將HepG2.2.15細胞分五組：(1)mock組：先加脂質(zhì)體LipofectamineTM2000作用6小時，繼續(xù)培養(yǎng)細胞48小時。(2)P1：轉(zhuǎn)染FoxO3a siRNA1，培養(yǎng)54h。(3)P1+PA組：轉(zhuǎn)染FoxO3a siRNA148小時后，400μmol/L軟脂酸培養(yǎng)6小時。(4)NC組：轉(zhuǎn)染siRNA-NC后，培養(yǎng)54小時。(5

10、)NC+PA組：轉(zhuǎn)染siRNA-NC48dx時后，400μmol/L軟脂酸培養(yǎng)6小時。
　　 三、FOXO3a在非酒精性脂肪性肝病患者外周血單個核細胞中的表達及其與疾病活動性的關(guān)系
　　 1、收集符合非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)診斷的患者42例，其中非酒精性單純性脂肪肝(SS)20例、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)22例；另選健康體檢者20例為對照組。
　　 2、RT-PCR檢測NAFLD患者外周血單個核細胞

11、FoxO3a mRNA、Bim mRNA、p27kip1 mRNA。
　　 3、分析各組之間各指標的差異并對各指標與FoxO3a mRNA進行線性多元回歸分析。
　　 結(jié)果：
　　 1、細胞內(nèi)脂滴和TG含量隨時間增加而逐漸增加。
　　 2、隨著軟脂酸濃度的逐漸增加，細胞存活率逐漸下降，而凋亡率、Caspase3活性逐漸增加，并皆與濃度相關(guān)。
　　 3、隨著軟脂酸培養(yǎng)時間的延長，細胞存活率逐漸下降；

12、而凋亡率、Caspase3活性逐漸增加，并皆與時間相關(guān)。
　　 4、隨著軟脂酸培養(yǎng)時間的延長，Bim mRNA、p27kip1 mRNA的表達逐漸增加；各組HepG2.2.15細胞總Fox03a蛋白無明顯改變、p-FoxO3a蛋白隨作用時間延長逐漸減少。HepG2.2.15細胞Fox03a蛋白表達明顯高于L02細胞。
　　 5、siRNA在50nmol/L時熒光最強。
　　 6、P1(FoxO3asiRNA1)、

13、P2(FoxO3asiRNA2)組對FoxO3a mRNA均有抑制作用(P<0.05)，隨著時間的延長抑制增強(P<0.05)。P3(FoxO3asiRNA3)組siRNA無明顯抑制作用(P>0.05)。P1(siRNA1)的抑制效果最好。P1組FoxO3a蛋白表達隨時間逐漸下降；
　　 7、P1組細胞核的綠色熒光非常弱，細胞漿的綠色熒光較強；P1+PA組細胞核的綠色熒光有所增加，細胞漿的綠色熒光減少；
　　 8、NC組

14、、P1組、mock組凋亡率、Caspase3活性無明顯改變(P>0.05)。P1+PA組與NC+PA組相比，凋亡率、Caspase3活性下降(P<0.05)。
　　 9、NC組、P1組、mock組Bim mRNA、p27kip1 mRNA表達無明顯差異(P>0.05)。P1+PA組比NC+PA組表達明顯減少(P<0.05)。
　　 10、P1+PA組、P1組總FoxO3a蛋白明顯減少(P<0.05)，而其它各組基本相同。

15、mock組和NC組p-FoxO3a蛋白基本相同，而NC組+PA組最低，P1+PA組較P1組p-Fox03a蛋白減少。
　　 11、臨床研究：除年齡以及身高外，NAFLD患者與健康對照組的BMI、WHR、FFA、HDL-C、TC、TG、LDL-C、GPT差別皆有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.001)。而NASH組BMI、WHR、LDL-C、FFA、HDL-C、TC、GPT高于SS組(P<0.05或P<0.001)；健康對照組、

16、SS組和NASH組的FOX03a rnRNA和Bim mRNA、p27kip1mRNA表達逐漸增加(P<0.05或P<0.001)；FoxO3a mRNA與BimmRNA呈線性相關(guān)。經(jīng)多元線性回歸分析得出WHR、FFA、TG、BMI、LDL-C與FOXO3a mRNA相關(guān)性大，而其中以腰臀比(WHP)的影響最大(復相關(guān)系數(shù)R=0.953，決定系數(shù)R2=0.908)。在經(jīng)調(diào)整飲食、控制體重和服用降脂藥物等綜合治療后，WHR、血脂等較治療前

17、明顯好轉(zhuǎn)(P<0.05或P<0.001)，F(xiàn)oxO3a mRNA表達下降(t=23.25，P<0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、軟脂酸可誘導細胞脂肪變性和凋亡，并對細胞存活率、凋亡率、Caspase3活性的影響呈濃度和時間依賴性。
　　 2、軟脂酸可引起促凋亡因子Bim、p27kip1明顯上調(diào)，導致凋亡的發(fā)生。
　　 3、軟脂酸可活化轉(zhuǎn)錄因子FoxO3a，HepG2.2.15細胞高表達Fox03a。<

18、br>　　 4、FoxO3a siRNA1的抑制效果最好
　　 5、FoxO3a siRNA1單獨不能誘導HepG2.2.15細胞凋亡，在軟脂酸刺激下針對FoxO3a的siRNA1能通過降低Caspase3活性、抑制Bim、p27kip1的表達，從而減少細胞的凋亡。軟脂酸通過促進FoxO3a去磷酸化(失活)和核移位而調(diào)節(jié)凋亡。
　　 6、NAFLD患者血脂明顯增加，F(xiàn)oxO3a mRNA在NAFLD外周血單個核細胞表達