氧化高密度脂蛋白對體外培養(yǎng)的兔樹突狀細胞的成熟與趨化因子MCP-1分泌的影響.pdf

1、冠心病（coronary heart disease，CHD）是最常見的心腦血管疾病之一，其發(fā)病率逐漸增高，1998年至2008年間，我國男性冠心病發(fā)病率較以往同期約增加26%，女性約增加19%，其死亡率也呈迅速上升趨勢，是我國居民死因構成中上升最快的疾病，已成為威脅我國公眾健康的重要疾病，如何有效防治是醫(yī)療行業(yè)和社會關注的重點。但是CHD的發(fā)病機制至今仍不完全明了，成為阻礙其治療進展的主要難題。動脈粥樣硬化（atheroscleros

2、is，AS）是CHD的主要病理基礎。以往關于AS形成的機制主要圍繞三種學說：脂質(zhì)沉淀學說、損傷修復學說和血栓形成學說。高血壓、吸煙、血脂異常、糖尿病、超重和肥胖、年齡、性別、高半胱氨酸血癥以及高尿酸血癥等導致血管內(nèi)皮損傷和脂質(zhì)沉積的內(nèi)在因素，被認為是CHD發(fā)病的高危因素。遠離這些危險因素，或者控制這些因素的惡化，均可在一定程度上取得預防AS發(fā)生發(fā)展的效果。近年來，隨著急性冠脈綜合癥（acute coronary syndrome，ACS

3、）這個CHD的急性進展階段的界定，使得人們重新認識了CHD發(fā)展階段的病理和病理生理特點。ACS的病理基礎是易損斑塊，研究發(fā)現(xiàn)易損斑塊伴隨著大量炎癥細胞和免疫細胞的介入，是斑塊不穩(wěn)定和容易破裂的主要原因；ACS患者存在全身炎癥因子和炎癥反應活化的情況。進一步研究發(fā)現(xiàn)AS的所有階段都有免疫細胞的介入，于是提出CHD是一種慢性炎癥和自身免疫性疾病這一新觀點，認為內(nèi)在或外在危險因素導致的炎癥和免疫反應是AS發(fā)病的基礎。 本課題分為兩個部

4、分，第一部分研究在hGM-CSF+hIL-4作用下體外培養(yǎng)。誘導兔外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）以及骨髓單個核細胞（bone marrow monouclear cells，BMMC）轉(zhuǎn)化為DCs的方法，并采取LPS誘導DCs的成熟，旨在為AS的組織工程和臨床細胞診斷、治療的研究奠定基礎。第二部分利用熒光染料DiI標記ox-HDL，在體外觀察DCs對其的捕獲過程及ox-H

5、DL誘導DCs成熟情況，探討ox-HDL對DCs成熟的影響，并利用ELISA方法，在體外觀察ox-HDL對DCs趨化因子MIP-1α和MCP-1分泌，為進一步研究ox-HDL抗原呈遞機制及動脈粥樣硬化形成機制研究奠定基礎。其結果分述如下： 1兔PBMC源性及BMMC源性DCs體外培養(yǎng)的研究 通過密度梯度離心的方法收集到的單只兔外周血20mL轉(zhuǎn)化為DCs的數(shù)量約為10-20×106，單只兔骨髓液10mL轉(zhuǎn)化為DCs的數(shù)量約

6、為5-10×106。 1.1細胞的形態(tài)學結果 培養(yǎng)第2天對照組細胞粘附于聚苯乙烯培養(yǎng)瓶底部，DC組的細胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長，細胞較小，形態(tài)無明顯差別。培養(yǎng)第6天對照組的細胞呈圓形或橢圓形，粘附于培養(yǎng)瓶瓶底，掃描電鏡下細胞呈圓形及橢圓形，表面有小桿狀突起；DC組的細胞懸浮生長，可見部分細胞聚集成簇，細胞表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起，掃描電鏡下細胞呈不規(guī)則形，表面粗糙，胞體有形態(tài)不一的突起。 1.2細胞

7、的流式細胞學表型分析結果 培養(yǎng)6天后外周血源性DC組與骨髓源性DC組的細胞MHCⅡ、CD86高表達，CD14低表達。相同來源的不同細胞各組間行獨立樣本t檢驗：外周血源性DC組與外周血源性對照組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異有顯著性意義（P<0.001），骨髓源性DC組與骨髓源性對照組MHCⅡ、CD86、CD14比較差異有顯著性意義（P<0.001）。不同來源的同類細胞行各組間行獨立樣本t檢驗：外周血源性DC組與骨髓源性D

8、C組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異無顯著性意義（P>0.05），外周血源性對照組與骨髓源性對照組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異無顯著性意義（P>0.05）。析因設計資料的方差分析提示不同標本來源的細胞間比較差異無顯著性意義（P>0.05），不同刺激方法培養(yǎng)的細胞間比較差異有顯著性意義（P<0.001）。 1.3吞噬功能檢測 成熟DCs的吞噬功能下降，主要表現(xiàn)為抗原呈遞功能，為此用流式的方法比較巨噬細胞和成

9、熟DCs在37℃條件下對FITC-dextran的攝取能力的差異。析因設計資料的方差分析提示不同標本來源的細胞間比較差異無顯著性意義（P>0.05），不同刺激方法培養(yǎng)的細胞間比較差異有顯著性意義（P<0.001）。兩組間獨立樣本t檢驗結果顯示，外周血源性DCs組和骨髓源性DCs組細胞吞噬能力表達較低，兩種來源的對照組細胞吞噬能力表達較強。外周血源性DC組與骨髓源性DC組之間、外周血源性對照組與骨髓源性對照組之間比較差異無顯著性意義（P>

10、0.05），外周血源性DC組與外周血源性對照組之間、骨髓源性DC組與骨髓源性對照組之間比較差異有顯著性意義（P<0.001）。 2 ox-HDL對兔PBMC源性DCs的成熟及趨化因子分泌的影響 2.1 DCs的培養(yǎng)和觀察 倒置相差顯微鏡下：培養(yǎng)第2天各組細胞部分在培養(yǎng)基中懸浮生長，細胞較小，圓形。培養(yǎng)第5天細胞懸浮生長，可見部分細胞聚集成簇，細胞形態(tài)不規(guī)則，表面可見數(shù)量不等、形態(tài)不一的樹突樣突起，細胞質(zhì)變得豐富。

11、加入50μg/mLHDL、ox-HDL后，細胞形態(tài)無明顯改變，細胞大部分懸浮或半貼壁，少數(shù)貼壁。 2.2 DCs對DiI標記的ox-HDL的加工處理和抗原呈遞 DCs與DiI標記的ox-HDL混合孵育2小時，熒光顯微鏡觀察顯示原本無色的DCs，在攝取了經(jīng)DiI標記的ox-HDL后，胞漿也變的紅染，培養(yǎng)2天后，這種情況則顯示更為明顯。DiI良好顯示DCs攝取ox-HDL抗原和成熟過程。DCs開始為較小的幼稚多形細胞，其攝

12、取抗原過程清晰可見，在攝取抗原后逐漸發(fā)育變大，胞漿逐漸豐富，變?yōu)椴灰?guī)則多型狀態(tài)，并有較多偽足伸出。 2.3 ox-HDL對DCs表型的影響 收集干預48h的懸浮細胞，經(jīng)FACS分析顯示，與陰性對照PBS組相比，經(jīng)HDL及ox-HDL處理的DCs其表面分子CD86和MHCⅡ的表達均上調(diào)，CD14的表達均下調(diào)。行One-Way ANOVA檢驗，MHCⅡ、CD86、CD14（CD14方差不齊，采用Welch法校正）在各組間差異

13、有顯著性意義（P<0.001）。Dunnett'sT3多重比較提示HDL組與PBS組的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異無顯著性意義（P>0.05），ox-HDL組與PBS組之間（P<0.001）、ox-HDL組與HDL組之間（P<0.01）的MHCⅡ、CD86、CD14比較差異均有顯著性意義。 2.4與ox-HDL共同培養(yǎng)的DCs上清液趨化因子MIP-1α和MCP-1檢測結果： 上清液趨化因子MIP-1α的ELISA

14、檢測結果進行析因設計資料的方差分析提示：時間因素對上清液的MIP-1α表達量的影響有顯著性意義（F=34.520，P<0.001），分組因素（培養(yǎng)環(huán)境中的干預因素）對上清液的MIP-1α表達量的影響無顯著性意義（F=0.722，P>0.05）。繼續(xù)行One-Way ANOVA檢驗顯示不同時間段的MIP-1α表達量不同，多重比較顯示除HDL組在24小時與48小時之間差異無顯著性意義外（P=0.102），其余各時間段之間的兩兩比較，其MIP

15、-1α表達量差異均有顯著性意義（P<0.05），但是不同分組，即按不同干預條件對各時間段的上清液MIP-1α表達量影響均無顯著性意義（P>0.05）。 上清液趨化因子MCP-1的ELISA檢測結果進行析因設計資料的方差分析提示：時間因素對上清液的MCP-1表達量的影響有顯著性意義（F=31.481，P<0.001），分組因素對上清液的MIP-1α表達量的影響有顯著性意義（F=47.931，P<0.001）。繼續(xù)行One-Way

16、ANOVA及Dunnett's T3多重比較提示：不同時間段的MCP-1表達量不同，除PBS組在12小時與24小時之間差異無顯著性意義外（P=0.383），其余各時間段之間的兩兩比較，MCP-1表達量差異均有顯著性意義（P<0.001）。不同分組，即不同干預條件對各時間段的上清液MCP-1表達量影響差異有顯著性意義（P<0.001），多重比較顯示ox-HDL的影響與其他因素單獨比較，在各時間段的差異均有顯著性意義（P<0.05）。

17、 通過上述兩個章節(jié)實驗，我們總結以下結論和創(chuàng)新： （1）兔PBMC及BMMC均能在hGM-CSF+hIL-4的作用下經(jīng)過5天的培養(yǎng)被誘導分化為DCs，但PBMC源性的DCs表型表達的陽性率高于BMMC源性的DCs。經(jīng)過LPS的作用，兩種來源的DCs均能轉(zhuǎn)化為成熟樹突狀細胞； （2）體外培養(yǎng)的兔PBMC源性DCs經(jīng)過ox-HDL的干預，其CD86、MHCⅡ表達上調(diào)，CD14表達下調(diào)，符合成熟DCs的特征。 （3）