MicroRNA-221及EphA2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中關(guān)于生長(zhǎng)、凋亡等方面作用的研究.pdf

1、目的： 探索microRNA-221及EphA2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中的表達(dá)情況及研究?jī)烧咴赨251細(xì)胞增殖、凋亡等方面所起的作用。尋找診斷膠質(zhì)瘤及潛在應(yīng)用于膠質(zhì)瘤基因治療的新方法。 方法： 第一部分： 1、通過(guò)查閱文獻(xiàn)得知，microRNA-221(miRNA-221)在多個(gè)神經(jīng)膠質(zhì)瘤標(biāo)本及多種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于正常腦組織標(biāo)本。由此推斷miRNA-221在膠質(zhì)瘤形成過(guò)程中可能是癌基因。

2、 2、體外化學(xué)合成針對(duì)miRNA-221的2’-甲氧修飾的反義寡核苷酸單鏈和非特異性陰性對(duì)照單鏈miRNA。 3、采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將合成的miRNA-221的反義鏈轉(zhuǎn)染入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中，用CCK-8及AnnexinV/PI試劑盒檢測(cè)細(xì)胞的增殖和凋亡情況。 第二部分： 1、RT-PCR檢測(cè)U251細(xì)胞和U87細(xì)胞系及正常腦組織標(biāo)本中EphA2基因的表達(dá)情況； 2、體外合成靶向EphA2基因

3、的特異性siRNA和非特異性陰性對(duì)照siRNA，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法將siRNA導(dǎo)入膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞系中，并用Real-timePCR和Western blot方法檢測(cè)siRNA-EphA2對(duì)U251細(xì)胞中EphA2表達(dá)的影響； 3、觀察特異性siRNA轉(zhuǎn)入U(xiǎn)251細(xì)胞后是否引起膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的降低及是否可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。以此來(lái)研究EphA2基因在膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)和侵襲轉(zhuǎn)移方面的作用。 結(jié)果： 第一

4、部分：用脂質(zhì)體方法把miRNA-221的反義鏈轉(zhuǎn)染入U(xiǎn)251細(xì)胞后。 1、用CCK-8檢測(cè)到實(shí)驗(yàn)組膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)速度與陰性對(duì)照組相比受到了明顯的抑制。 2、流式細(xì)胞儀檢測(cè)到轉(zhuǎn)染對(duì)照組miRNA細(xì)胞的凋亡率為3.07％，轉(zhuǎn)染miRNA-221反義序列組的細(xì)胞凋亡率為4.12％，三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)均表明兩組之間細(xì)胞凋亡率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。 第二部分： 1、通過(guò)基因水平檢測(cè)，EphA2基因在膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞中

5、的表達(dá)水平明顯高于正常腦組織； 2、用Western blot方法檢測(cè)轉(zhuǎn)染siRNA-EphA2后U251細(xì)胞中EphA2蛋白表達(dá)量，轉(zhuǎn)染10 nM時(shí)，蛋白的抑制率與陰性對(duì)照組相比達(dá)到50％，50 nM時(shí)蛋白的抑制率為70％；用Real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染10 nM、50 nM siRNA-EphA2后EphA2 mRNA的表達(dá)水平與陰性對(duì)照組相比分別降低了45％、70％； 3、流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照組細(xì)胞的凋

6、亡率為6.56％，轉(zhuǎn)染siRNA-EphA2組的凋亡率為28.21％，凋亡率的差別有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義； 4、以50 nM濃度轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度及遷移、侵襲能力較陰性對(duì)照組明顯下降。 結(jié)論： 1、MiRNA-221在膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中，可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。但在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡方面沒(méi)有顯著的作用。 2、EphA2基因在正常腦組織標(biāo)本中的表達(dá)明顯低于兩種膠質(zhì)瘤細(xì)胞系。 3、應(yīng)