臘梅脂轉(zhuǎn)移蛋白基因克隆與功能的初步分析.pdf

1、非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白是病程相關(guān)的蛋白。被定位在細(xì)胞膜上，在體外可以轉(zhuǎn)運(yùn)磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇和磷脂酰絲氨酸?？咕鷮?shí)驗(yàn)表明具有抑制真菌、細(xì)菌生長的能力，同時可能具有抗蟲害的潛力，大量的研究還表明非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白還參與蠟質(zhì)形成等。因此研究非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白基因有重要的意義。非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白已從多種植物中分離得到，并通過生物技術(shù)克隆了大量的非特異脂轉(zhuǎn)移蛋白的基因。從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的蠟梅花cDNA文庫中，利用EST技術(shù)從蠟梅中第一次克隆了兩個非特異脂轉(zhuǎn)

2、移蛋白基因。通過生物信息學(xué)手段，對基因序列進(jìn)行了分析和功能預(yù)測。為了進(jìn)一步驗(yàn)證其可能的功能，構(gòu)建了兩個植物表達(dá)載體，通過煙草的轉(zhuǎn)化獲得了一批轉(zhuǎn)基岡植株，并對轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了初步分析，主要研究及結(jié)果如下： 1、克隆子的獲得在文庫中隨機(jī)挑選克隆，提取質(zhì)粒DNA，以文庫克隆予質(zhì)粒為模板，利用EST序列DW222703設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小(388bp)的特異片段；利用EST序列DW223106設(shè)計(jì)特異引物擴(kuò)增出預(yù)計(jì)大小(446bp

3、)的特異片段，以文庫克隆載體pTriplEx2引物對DW222703擴(kuò)增出約613bp，對DW223106擴(kuò)增出653bp的特異片段，經(jīng)生物信息學(xué)分析、網(wǎng)上比對均顯示，從文庫中獲得的CH0092的克隆子代表的基因?yàn)镋ST序列DW222703對應(yīng)的全長cDNA。從文庫中獲得的CH001477的克隆子代表的基因?yàn)镋ST序列DW223106對應(yīng)的全長cDNA。 2．序列分析 對兩個目標(biāo)基因進(jìn)行了序列分析，兩個基因分別由613和

4、653個核苷酸組成，分別包含一個360和一個351個核苷酸的ORF，分別編碼蛋白長119和116個氨基酸。兩個基因編碼的蛋白理論分子量分別為12.1kD和11.7kD，預(yù)測等電點(diǎn)分別為8.57和9.05。 3．表達(dá)載體的構(gòu)建兩個nsLTPs基因均在克隆載體pTriplEx2上，將菌液活化并用X-balI和SmalI雙酶切，最后連入表達(dá)載體PC2301上，酶切驗(yàn)證構(gòu)建成功PC2301-nsLTP表達(dá)載體。 4．目的基因的轉(zhuǎn)

5、化和植株再生采用葉盤法，通過農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)介導(dǎo)分別將nsLTP92和nsLTP1477兩個脂轉(zhuǎn)移蛋白基因分別導(dǎo)入了煙草，各獲得10多株轉(zhuǎn)基因煙草。 5．轉(zhuǎn)基因煙草的分子生物學(xué)鑒定首先對篩選到的抗性植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)檢測，初步表明基因轉(zhuǎn)入并整合進(jìn)煙草植株基因組中。然后對GUS染色呈陽性植株再進(jìn)行PCR檢測。結(jié)果表明GUS陽性株系均出現(xiàn)一條與陽性對照相同的特異帶，而非轉(zhuǎn)化植株則未得劍

6、該特異帶。 6．轉(zhuǎn)基因植株的抗蚜蟲實(shí)驗(yàn)對轉(zhuǎn)基岡nsLTP92和nsLTP1477植株的陽性株進(jìn)行了蚜蟲的抗性統(tǒng)計(jì)，方差分析表明當(dāng)p=0.05時，編號為nsLTP92-1，nsLTP92-3,nsLTP92-4,nsLTP92-5的轉(zhuǎn)基因植株蚜蟲抗性分析與對照株有差異，而其他轉(zhuǎn)基因植株與對照株均籌異不顯著，初步說明蠟梅基因nsLTP92可能具備抑制蚜蟲的作用，而基因nsLTP1477則不具備抑制蚜蟲的功能7．轉(zhuǎn)基因植株的田問觀測對轉(zhuǎn)基岡n