低磷脅迫大豆RT-qPCR內(nèi)參基因的篩選及谷胱丙肽合成代謝酶的表達(dá).pdf

1、磷是植物的必要元素之一，缺磷使植物的生長(zhǎng)活動(dòng)受到影響。谷胱甘肽(Glutathione，GSH)是普遍存在于植物體內(nèi)的抗氧化劑，在植物抵抗低磷脅迫中起重要作用。GSH是植物細(xì)胞內(nèi)主要的還原性物質(zhì)，其通過(guò)Asada-Halliwell的方式，有效清除植物生理生化活動(dòng)產(chǎn)生的過(guò)多的活性氧，保護(hù)植物體內(nèi)生物大分子物質(zhì)免受活性氧的傷害。GSH是在γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-ECS)和谷胱甘肽合成酶(hGSHS)的催化作用完成的，γ-ECS和hG

2、SHS分別由γ-ECS和hGSHS基因編碼。γ-ECS和hGSHS基因表達(dá)量、γ-ECS和hGSHS酶活水平、GSH的含量之間相互作用來(lái)有效應(yīng)對(duì)逆境脅迫。植物絡(luò)合素(Phytochelatins，PC)是以GSH為反應(yīng)底物合成的，PC可由外界重金屬離子誘導(dǎo)產(chǎn)生，PC通過(guò)Cys上的硫基結(jié)構(gòu)與重金屬離子螯合以減少重金屬離子對(duì)植物的毒害作用。大豆中的GSH類物質(zhì)為谷胱丙肽(Homoglutataione，hGSH)，hGSH幾乎具有GSH的所

3、有功能;同樣大豆中的同源植物絡(luò)合素(Homophytochelatin，hPC)亦能實(shí)現(xiàn)PC的所有功能。篩選穩(wěn)定的內(nèi)參基因是實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time quantitativePCR，RT-qPCR)的先決條件。
　　本實(shí)驗(yàn)以大豆耐低磷品種桂夏2號(hào)(GX2)和低磷敏感品種桂香1號(hào)(GX1)為材料，對(duì)大豆進(jìn)行1/5 Hoagland全營(yíng)養(yǎng)液和低磷(0.2μmol/L KH2PO4)處理，收集2d、4d、8d、12 d和1

4、6 d根尖和葉片為材料，采用GeNorm分析法、NormFinder分析法、BestKeeper分析法、△Ct對(duì)比分析法和RefFinder分析法分析低磷脅迫下15個(gè)內(nèi)參基因(18sRNA,ACT,ATP,CYP,Ef1-α,Ef1-β,G6PDH,PE,PP2A,PSC,TIF,TUB,UNK1,UNK2，Letin)的穩(wěn)定性，并選用最穩(wěn)定的內(nèi)參基因計(jì)算不同磷脅迫時(shí)期γ-ECS和hGSHS的表達(dá)水平，同時(shí)運(yùn)用分光光度法研究了不同磷脅迫

5、時(shí)期γ-ECS和hGSHS的酶活力水平，使用液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)了低磷脅迫下hGSH和hPCs的含量變化。
　　結(jié)果:在所有樣品組中最穩(wěn)定性最好是PSC、18sRNA和TUB，穩(wěn)定性排在最后的是PE和CYP;低磷實(shí)驗(yàn)組，穩(wěn)定性最好的是PP2A;空白組，ACT是最穩(wěn)定最好的內(nèi)參基因;葉片中顯示TIF穩(wěn)定性最好;根部顯示穩(wěn)定性最佳的是PE。根據(jù)對(duì)15個(gè)內(nèi)參基因配對(duì)差異分析，本實(shí)驗(yàn)宜同時(shí)使用3個(gè)內(nèi)參基因(PSC,18sRNA和TUB)計(jì)算γ-

6、ECS和hGSHS的相對(duì)表達(dá)量(Fold change，F(xiàn)C)。低磷脅迫下，GX1根部和葉部γ-ECS和hGSHS的相對(duì)表達(dá)量都隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而呈現(xiàn)減少趨勢(shì);GX2根部γ-ECS和hGSHS的相對(duì)表達(dá)量都隨著脅迫時(shí)間延長(zhǎng)而增加;葉片中，γ-ECS的相對(duì)表達(dá)量亦呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，而hGSHS的相對(duì)表達(dá)量則減少;GX2的根部和葉部γ-ECS和hGSHS的酶活力都隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)而上升，且根部上升的幅度要大于葉部，hGSH含量在GX2的根部和葉