應(yīng)用RT-qPCR研究褪色橘蚜對CTV的傳播特性.pdf

1、由柑橘衰退病毒(Citrustristezavirus，CTV)引起的柑橘衰退病是一種具有經(jīng)濟重要性的柑橘病毒病害，其主要傳播方式為嫁接和媒介昆蟲。而橘蚜被認為是柑橘衰退病發(fā)生流行的主要有效傳播介體，以非循回半持久方式傳播。大多數(shù)非增殖型傳播的病毒在昆蟲體內(nèi)濃度很低，血清學(xué)方法靈敏度低，所以檢測昆蟲中病毒比較困難。RT-nested-PCR已用來檢測蚜蟲中CTV，但其操作復(fù)雜，易污染。隨著qPCR技術(shù)的發(fā)展，實現(xiàn)了定量檢測蚜蟲攜帶CTV

2、數(shù)量。實時熒光定量RT-PCR方法簡單、靈敏度高且線性范圍較大，是一種有效定量檢測方法。目前學(xué)者多用TaqMan探針法進行定量檢測，成本較高，而有關(guān)SYBRGreenⅠ染料法檢測橘蚜體內(nèi)CTV沒有較好的體系。
　　 影響蚜蟲傳毒效率的因素有CTV株系、毒源植物和接種植物的種類、蟲口數(shù)目、獲毒時間、蚜蟲的發(fā)育蟲態(tài)以及環(huán)境條件等，但對于不同獲毒時間后橘蚜中CTV數(shù)量及橘蚜攜帶同一CTV株系數(shù)量與其傳毒率的相關(guān)性尚無報道。
　　

3、 因此本研究設(shè)計并合成了一對擴增CP25基因片段的特異性引物HD-F/HD-R，摸索和優(yōu)化實時熒光定量RT-PCR反應(yīng)體系的條件參數(shù)等，建立了一種成本低、特異性好、靈敏度高的SYBRGreenⅠ實時熒光定量RT-PCR檢測方法;進行了3個CTV分離株單蚜傳毒試驗，分析了單蚜分離株CP/HinfⅠRFLP組群構(gòu)成;研究了褐色橘蚜蟲口密度對CT16-2傳毒率的影響，應(yīng)用實時熒光定量RT-PCR測定了單頭褐色橘蚜獲毒24h后攜帶毒源CT16

4、-2的數(shù)量，測定了15頭褐色橘蚜在4個CTV分離株上獲毒0.5-48h后CTV數(shù)量，分析了橘蚜獲毒量隨獲毒時間的變化及其與傳毒率的相關(guān)性。本研究為進一步研究CTV的流行病學(xué)、蚜傳機制、蚜蟲-CTV-寄主相互作用提供了基礎(chǔ)。
　　 主要研究成果:
　　 1.在高度保守區(qū)CP25設(shè)計特異性引物HD-F/HD-R建立了檢測褐色橘蚜中CTV實時熒光定量RT-PCR檢測體系;
　　 2.該體系特異性強，對裂皮病、碎葉病、溫

5、州蜜柑萎縮病、鱗皮病無特異性擴增，靈敏度高，最低檢測限為9.0×10°拷貝/μL，比常規(guī)RT-PCR靈敏100倍，擴增效率高、線性范圍廣、重復(fù)性好，是橘蚜中CTV定量分析的有效手段。
　　 3.橘蚜在毒源上獲毒24h后帶毒率為100％，單頭橘蚜中CTV最低含量為2.5×103拷貝，最高含量為1.24×106拷貝，但是總體來看每頭橘蚜中CTV數(shù)量主要集中于104-105拷貝。
　　 4.CTV分離株CT14A、CT11A、

6、CT16-2單蚜傳毒率分別為57.14％、70.27％、15.56％。這3種毒源及其單蚜分離株的CP/HinfⅠRFLP組群均屬于單一的第三組群。
　　 5.蟲口密度越大，傳毒率越高。其中1頭、3頭、5頭、10頭、15頭、25頭橘蚜獲毒24h傳毒24h的傳毒率分別為:15.56％、62.50％、69.23％、81.25％、91.60％、96.67％。
　　 6.在CT11A、CT16-2、CT立間3種毒源上獲毒不同時間1

7、5頭橘蚜中CTV拷貝數(shù)主要集中于106拷貝，最低為104拷貝，最高為107拷貝;以CT14A為毒源時CTV拷貝數(shù)主要集中于105拷貝，最低為104拷貝，最高為106拷貝，明顯低于其他三種毒源。
　　 7.CT11A、CT16-2、CT立間為毒源時，隨獲毒時間變化橘蚜獲毒量的趨勢基本相同，即獲毒0.5h橘蚜中CTV含量最低，分別為2.08×105±4.29×104、7.80×104±1.54×104、5.95×104±2.56×1

8、04拷貝，隨著時間延長，獲毒量升高，4-6h橘蚜獲毒量最高，分別為:2.32×107±5.46×106、1.71×107±3.68×106、9.38×106±2.97×106拷貝，6h之后，獲毒量又有所下降。
　　 8.以強毒株CT14A為毒源時，隨著獲毒時間延長橘蚜中CTV數(shù)量呈整體上升趨勢，0.5h獲毒量最低，為3.39×104±8.44×103拷貝;48h獲毒量最高，為2.35×105±3.29×105拷貝;但是在6-9h

9、獲毒后橘蚜中CTV數(shù)量已達到一小高峰，趨勢與其他三種毒源類似。
　　 9.以CT16-2為毒源時，獲毒6h后，橘蚜中CTV含量最高，其傳毒率也較高，達90.91％。隨著獲毒時間的延長(9h、12h、24h)橘蚜中CTV含量低于6h，但其傳毒率仍保持較高水平，均大于90％;橘蚜獲毒0.5h和3h獲毒量較低，傳毒率也較低，僅為20％，因此，獲毒時間較短不利于傳毒，6h獲毒即可保證較大傳毒率。傳毒率與橘蚜中CTV含量有一定相關(guān)性，橘蚜