CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)破骨細(xì)胞分化、功能及其分泌物金屬基質(zhì)蛋白酶的影響.pdf

1、目的：
　　 骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一組全身性的骨骼疾病,其特征是骨量減少或(和)骨組織微結(jié)構(gòu)破壞,從而導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降,骨脆性增加,最終導(dǎo)致骨折的發(fā)生。OP發(fā)生的根本原因是骨吸收速度超過骨形成。而破骨細(xì)胞(osteoclasts,Ocs)在骨吸收過程中起著關(guān)鍵性作用。
　　 Ocs來源于單核/巨噬細(xì)胞譜系中的定向造血干細(xì)胞,該類細(xì)胞在巨噬細(xì)胞集落刺激因子(macrophage colony-sti

2、mulating factor,M-CSF)和細(xì)胞核因子κB活化因子配體(nuclear factor κ B activation factor ligand,RANKL)的作用下逐漸分化為成熟OCs。成熟Ocs通過分泌多種金屬基質(zhì)蛋白酶(matrix matalloproteinases,MMPs)降解骨基質(zhì)而發(fā)揮其骨吸收功能。而在MMPs中,MMP-2,3,7,9,13可能具有重要作用。
　　 CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)

3、胞是一種具有高度抑制功能的T細(xì)胞,是維持免疫系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的主要作用細(xì)胞。根據(jù)對(duì)已有文獻(xiàn)的理解,我們認(rèn)為,Ocs與CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞之間應(yīng)該具有必然的聯(lián)系。首先,OCs來源于單核/巨噬細(xì)胞,其本質(zhì)上歸屬于抗原呈遞細(xì)胞(antigen-presenting cells,APC),而作為T細(xì)胞的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)OCs理論上應(yīng)該具有調(diào)節(jié)作用;其次,多個(gè)文獻(xiàn)報(bào)告,在多種免疫疾病中,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid a

4、rthritis,RA)、系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)及炎性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)等患者常伴隨明顯的骨質(zhì)疏松,而該類患者外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的數(shù)目則有所下降。
　　 基于以上理解,我們研究了小鼠CIM+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)OCs分化及其分泌MMPs的影響,旨在從免疫學(xué)的角度說明骨質(zhì)疏松發(fā)生的一方面機(jī)制。

5、>　　 方法：
　　 1、免疫磁珠法(magnetic cell sorting,MACS)分選細(xì)胞
　　 利用MACS方法分別從小鼠脾臟及骨髓中分選出CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+CD25-T細(xì)胞和CD11b+細(xì)胞。利用相應(yīng)熒光抗體標(biāo)記后,流式細(xì)胞儀(flow cytometry,FCM)檢測細(xì)胞純度。將細(xì)胞置于適宜環(huán)境中分別培養(yǎng)。
　　 2、T細(xì)胞與CD11b+細(xì)胞共培養(yǎng)
　　 CD11b

6、+細(xì)胞在含有M-CSF、RANKL和骨片的培養(yǎng)體系中單獨(dú)培養(yǎng)3天后,分別與CD3抗體激活的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞或CD4+CD25-T細(xì)胞按照相應(yīng)比例共培養(yǎng)4天。
　　 3、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)OCs分化的作用
　　 共培養(yǎng)4天后,進(jìn)行酒石酸酸性磷酸酶(tartrate acid phosphate,TRAP)染色,觀察OCs形態(tài),同時(shí)計(jì)數(shù)OCs數(shù)目;對(duì)骨片進(jìn)行甲苯胺藍(lán)染色,觀察吸收陷窩的形態(tài),計(jì)數(shù)吸

7、收陷窩數(shù)目并測量吸收面積。
　　 4、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)OCs分泌MMPs的作用
　　 共培養(yǎng)2天后,利用酶聯(lián)免疫分析的(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法檢測培養(yǎng)上清中MMP-2,3,7,9的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1、MACS分選細(xì)胞純度
　　 根據(jù)流式結(jié)果,利用MACS方法分離得到的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、CD4+C

8、D25-T細(xì)胞和CD11b+細(xì)胞的純度均在90%以上。
　　 2、CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞對(duì)Ocs分化的作用
　　 (1)TRAP染色的結(jié)果顯示,與CD4+CD25-T細(xì)胞相比,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能顯著抑制OCs的生成(p＜0.01)。
　　 (2)甲苯胺藍(lán)染色的結(jié)果顯示,與CD4+CD25-T細(xì)胞相比,CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞能顯著抑制Ocs吸收陷窩的形成,并能顯著減少吸收面積(p＜0.