IL-37在人體外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞中的表達(dá)及其對(duì)免疫抑制功能的影響.pdf

1、目的:
　　1.證明白細(xì)胞介素-37(interleukin-37, IL-37)在人體外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)中表達(dá)。
　　2.研究CD4+CD25+Treg活化程度與表達(dá)IL-37的時(shí)效關(guān)系。
　　3.證明IL-37的表達(dá)與CD4+CD25+Treg發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)有關(guān)。
　　方法:
　　第一部分:通過免疫磁珠分離技術(shù),分離健康志愿者外周血

2、中CD4+CD25+Treg細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞技術(shù)鑒定CD4+CD25+Treg細(xì)胞純度。
　　1.增殖活性檢測(cè):設(shè)置刺激劑組(每1×105個(gè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞加入20μl Dynabeads?Human Treg Expender)、非刺激劑組、空白對(duì)照組(無細(xì)胞組),通過CCK-8法檢測(cè)各組CD4+CD25+Treg細(xì)胞增殖活性,得出時(shí)效關(guān)系(24h、48h、72h)。
　　2.IL-37表達(dá)情況檢測(cè):通過

3、Western blot技術(shù)檢測(cè)刺激劑作用下,不同時(shí)段(24h、48h、72h)IL-37表達(dá)水平的變化。
　　3.IL-37表達(dá)位置檢測(cè):采用免疫熒光技術(shù)與激光共聚焦技術(shù)檢測(cè)IL-37在Treg細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況與表達(dá)位置。
　　第二部分:通過免疫磁珠分離技術(shù),分離健康志愿者外周血中CD4+CD25+Treg細(xì)胞和 CD4+T細(xì)胞。通過 siRNA技術(shù)沉默 Treg細(xì)胞 IL-37表達(dá),分別設(shè)置siRNA-scramble干擾

4、后Treg細(xì)胞組、正常Treg細(xì)胞組、siRNA-IL37干擾后Treg細(xì)胞組。
　　1.SiRNA蛋白水平抑制效果檢測(cè):采用Western blot技術(shù)檢測(cè)沉默效果。檢測(cè) siRNA-scramble干擾后Treg細(xì)胞組、正常Treg細(xì)胞組、siRNA-IL37干擾后Treg細(xì)胞組在刺激劑作用72h時(shí),IL-37表達(dá)情況。
　　2.增殖活性檢測(cè):將CD4+CD25+Treg/CD4+CD25-T細(xì)胞共培養(yǎng)(按細(xì)胞計(jì)數(shù)1:1

5、比例),另設(shè)空白對(duì)照組(CD4+CD25-T細(xì)胞)。分別設(shè)siRNA-scramble干擾后Treg細(xì)胞組、正常 Treg細(xì)胞組、siRNA-IL37干擾后 Treg細(xì)胞組。每1×105個(gè)CD4+CD25+Treg細(xì)胞加入20μl Dynabeads?Human Treg Expender,采用CCK-8法檢測(cè)各組CD4+CD25+Treg對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞的抑制效應(yīng)。
　　3.采用Elisa技術(shù),檢測(cè)不同時(shí)間CD4+CD

6、25+Treg/CD4+CD25-T細(xì)胞組,空白對(duì)照組上清液中IL-2、IFN-γ/IL-4、IL-10、TGF-β水平的變化。
　　結(jié)果:
　　1.健康志愿者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMCs)經(jīng)過MACS兩次分選,應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)得到CD4+CD25+Treg純度達(dá)93％,CD4+CD25+Treg使用臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè),細(xì)胞活性大于97%。
　　2.應(yīng)用Dynabeads?Human Treg Expender對(duì)CD4+

7、CD25+Treg細(xì)胞刺激激活。采用CCK-8驗(yàn)證其增殖效果良好,并在刺激達(dá)到72h時(shí)最為明顯。
　　3.通過Western blot檢測(cè),CD4+CD25+Treg細(xì)胞表達(dá)IL-37;在Dynabeads?Human Treg Expender作用(24h、48h、72h),CD4+CD25+Treg表達(dá)IL-37水平增高(P<0.05)。
　　4.免疫熒光與激光共聚焦顯示,CD4+CD25+Treg表達(dá)IL-37,并且在

8、胞質(zhì)和細(xì)胞膜附近表達(dá)量較多。
　　5. CCK-8檢測(cè)T淋巴細(xì)胞增殖活性實(shí)驗(yàn)中,SiRNA-IL-37干擾組與正常Treg共培養(yǎng)組、SiRNA-scramble干擾Treg組比較,OD450值存在明顯升高(P<0.01),表明siRNA-IL-37干擾組Treg對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞抑制效應(yīng)下降;siRNA-IL-37干擾 Treg組與 CD4+CD25- T細(xì)胞對(duì)照組相比較,OD450值無明顯差異性(P>0.05),表明si

9、RNA-IL-37干擾組對(duì)CD4+CD25-T細(xì)胞抑制效應(yīng)微弱,與對(duì)照組無差異。
　　6.流式細(xì)胞檢測(cè)SiRNA-IL-37干擾Treg組與正常Treg細(xì)胞組在刺激劑作用24h, Foxp3、CTLA-4表達(dá)情況,結(jié)果顯示SiRNA-IL-37干擾Treg組較正常組Foxp3、CTLA-4分子表達(dá)下降均明顯(P<0.05),說明CD4+CD25+Treg細(xì)胞內(nèi)IL-37的表達(dá)能夠明顯影響CTLA-4和Foxp3的表達(dá),且兩者的表達(dá)

10、變化趨勢(shì)相同。
　　7.采用Elisa技術(shù),檢測(cè)正常CD4+CD25+Treg與siRNA-IL-37干擾CD4+CD25+Treg組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-10、TGF-β含量,結(jié)果表明siRNA干擾細(xì)胞兩因子含量均有明顯下降(P<0.01),表明CD4+CD25+Treg細(xì)胞IL-37的表達(dá)可能影響其抑制性細(xì)胞因子的生成。
　　8. siRNA-IL-37干擾Treg與CD4+CD25-T共培養(yǎng)組,72h檢測(cè)上清中IL-2

11、的濃度。檢測(cè)結(jié)果顯示,CD4+CD25-T細(xì)胞分泌IL-2,加入正常CD4+CD25+Treg細(xì)胞后IL-2濃度下降(P<0.01),但siRNA-IL-37干擾CD4+CD25+Treg細(xì)胞組IL-2分泌水平明顯上升(P<0.01)。陰性對(duì)照scramble干擾Treg組與CD4+CD25+Treg細(xì)胞組分泌情況無差異(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)中 IL-2由 T細(xì)胞分泌,干擾CD4+CD25+Treg細(xì)胞IL-37表達(dá)水平,共培養(yǎng)上清IL

12、-2濃度較正常對(duì)照組顯著增加,推斷IL-37在胞內(nèi)表達(dá)可能與Treg細(xì)胞抑制CD4+CD25-T細(xì)胞IL-2的分泌相關(guān)。
　　9. siRNA干擾 CD4+CD25+ TregIL-37表達(dá)后,其促進(jìn) Th2極化能力下降, IFN-γ/IL-4濃度比值上升,較正常對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01),效應(yīng) T細(xì)胞群向Th1趨勢(shì)極化。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾CD4+CD25+Treg表達(dá)IL-37,IFN-γ/IL-4顯著升高,因此,IL-

13、37蛋白在胞內(nèi)可能對(duì) CD4+CD25+Treg介導(dǎo)的 Th2極化具有重要作用。
　　結(jié)論:
　　1.健康人體外周血 CD4+CD25+Treg能夠表達(dá) IL-37,在新鮮提取的健康人CD4+CD25+Treg細(xì)胞中IL-37存在并少量表達(dá)。
　　2.隨著 CD4+CD25+Treg活化水平增高, IL-37表達(dá)水平逐漸升高,并在CD4+CD25+Treg細(xì)胞活性最強(qiáng)的72小時(shí)表達(dá)尤為明顯。IL-37在胞質(zhì)和細(xì)胞膜附近