流體切應力對破骨細胞CaⅡ、Cat K mRNA表達的影響.pdf

1、在口腔醫(yī)學領域，口頜系統(tǒng)處于復雜而精密調控的應力應變環(huán)境，許多生理過程和病理變化，如牙萌出、牙正畸性移動、種植體周圍炎、牙周炎等，與機械應力應變關系密切。機械刺激下發(fā)生的局部改建維持和重塑骨組織的結構，以適應外部力學環(huán)境的不斷變化。目前，骨細胞對載荷的反應特征及機械信號傳導的機制仍不清楚。生理性載荷不僅產生梯度張力，也產生局部梯度壓力，從而導致骨組織縫隙內的流體切應力。局部的流體切應力在骨組織的改建中發(fā)揮重要作用。研究骨細胞對不同載荷的

2、反應特征、力學信號在細胞中的傳導機制，是深入研究骨改建機理的重要內容，相關的細胞力學研究已成為口腔醫(yī)學、骨科學等諸多領域的研究熱點。 由于破骨細胞是終末分化細胞，細胞脆弱，組織含量少，目前尚不能傳代，體外培養(yǎng)和純化比較困難。而在體外獲得高產量高純度的破骨細胞又是進行分子生物學等相關研究的必要條件。因此，破骨細胞的分離純化成為進行分子水平的破骨細胞力學研究的技術瓶頸，也是相關研究的熱點之一。目前，在破骨細胞的培養(yǎng)和純化方面，尚未見

3、實驗動物年齡對培養(yǎng)質量的影響作用和對骨髓誘導培養(yǎng)的大鼠破骨細胞純化的報道。Ca Ⅱ和Cat K是破骨細胞主要的功能性酶，在骨組織泌酸脫礦和骨有機質降解中發(fā)揮關鍵作用，尚未見國內外文獻有關流體切應力作用下破骨細胞CaⅡ、Cat K表達水平的報道。本研究針對相關內容分三部分進行了探索： ①l,25-(OH)<,2>維生素D<,3>聯(lián)合地塞米松誘導SD大鼠骨髓破骨細胞的體外培養(yǎng)：以常用劑量的1，25-(OH)<,2>D<,3>(10<

4、'-7>mol／L)和DexamethaSOlle(10<'-8>mol／L)作為誘導劑，分別以1,25-(OH)<,2>D<,3>，單獨誘導和1,25-(OH)<,2>D<,3>聯(lián)合Dexamethasone誘導SD大鼠骨髓細胞，通過形態(tài)學分析、Trap染色、掃描電鏡和甲苯胺藍染色鑒定破骨細胞。單一組和聯(lián)合組均獲得Trap染色陽性、體外具有噬骨能力的多核破骨細胞。通過對培養(yǎng)第7天Trap陽性多核破骨樣細胞計數(shù)值的統(tǒng)計分析，驗證了在體外

5、培養(yǎng)破骨細胞方面，1,25-(OH)<,2>D<,3>。聯(lián)合DexamethaSOYle誘導優(yōu)于1,25-(OH)<,2>D<,3>單獨誘導。 ②胰酶消化法純化誘導不同年齡段SD大鼠骨髓破骨細胞的體外培養(yǎng)：以1,25-(OH)<,2>D<,3>聯(lián)合Dexamethasone誘導不同年齡段SD大鼠骨髓細胞，各年齡段SD大鼠均可獲得Trap陽性、具有噬骨能力的多核破骨細胞。不同年齡段SD大鼠的骨髓細胞對體外培養(yǎng)破骨細胞的效果有影響。

6、在第l至第36天年齡段，年齡越小，細胞活性越強。1,25-(OH)<,2>D<,3>/examethasorle誘導出生后10-12天的SD大鼠骨髓細胞，可保證細胞培養(yǎng)的穩(wěn)定性和可操作性，獲得較高產量的破骨細胞。采用胰蛋白酶／EDTA消化法純化，可獲得高純度的1,25-(OH)<,2>D<,3>／Dexamethasorle誘導的SD大鼠破骨細胞。 ③流體切應力與破骨細胞Ca Ⅱ、Cat K的表達：采用平行平板流體切應力加載系統(tǒng)

7、(專利號：200420034438)，以無血清的a-MEM音養(yǎng)基作為流動介質，對胰蛋白酶／EDTA消化法純化后的1,25-(OH)<,2>D<,3>聯(lián)合Dexamethasone誘導培養(yǎng)的SD大鼠(出生10-12天)破骨細胞，施加不同力值和作用時間的穩(wěn)定流體切應力，采用實時熒光定量巢式PCR檢測Ca Ⅱ、Cat K mRNA的表達。結果顯示，隨著力值的增加和作用時間的延長，Ca Ⅱ、Cat K mRNA的表達量均呈下降趨勢，各組樣本問的