膿毒癥早期大鼠下丘腦-垂體-腎上腺軸的變化及血必凈對(duì)其的影響.pdf

1、目的：目前膿毒癥的病死率高達(dá)30％-50％，一旦并發(fā)休克和多器官衰竭，其病死率可達(dá)80％-90％。臨床流行病學(xué)資料顯示，膿毒癥是危重患者的主要死亡原因之一，現(xiàn)已成為進(jìn)一步提高危重癥救治成功率的最大障礙。然而迄今為止，我們對(duì)于膿毒癥時(shí)機(jī)體的炎癥反應(yīng)機(jī)制還沒(méi)有充分闡明，神經(jīng).內(nèi)分泌.免疫網(wǎng)絡(luò)調(diào)節(jié)理論的形成與出現(xiàn)為膿毒癥發(fā)病機(jī)制的進(jìn)一步認(rèn)識(shí)提供了契機(jī)，在神經(jīng)內(nèi)分泌免疫網(wǎng)絡(luò)研究中，下丘腦.垂體.腎上腺（HPA）軸備受關(guān)注。HPA軸是神經(jīng)內(nèi)分泌免

2、疫網(wǎng)絡(luò)的樞紐，深入研究其機(jī)制有望開(kāi)辟膿毒癥臨床干預(yù)的新途徑。HPA軸作用的終點(diǎn)為糖皮質(zhì)激素的釋放，而糖皮質(zhì)激素要與糖皮質(zhì)激素受體（GR）結(jié)合發(fā)揮作用。GR是機(jī)體內(nèi)部主要的抗炎分子之一，是糖皮質(zhì)激素效應(yīng)發(fā)揮的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。
　　 血必凈注射液的主要有效成分包括紅花黃色素A、川芎嗪、丹參素、阿魏酸、芍藥苷、原兒茶醛。血必凈注射液能在體內(nèi)外有效拮抗內(nèi)毒素，抑制體內(nèi)多種炎性介質(zhì)的病理生理作用，恢復(fù)受到抑制的免疫反應(yīng)，對(duì)應(yīng)激性臟器損傷具有良好

3、的保護(hù)和修復(fù)作用。
　　 本研究利用盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法復(fù)制大鼠膿毒癥模型，探討膿毒癥早期大鼠下丘腦組織促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素（CRH），血漿促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）、皮質(zhì)酮（CORT）水平以及腎上腺組織糖皮質(zhì)激素受體mRNA（GR mRNA）水平的變化，以及血必凈注射液干預(yù)后上述指標(biāo)的變化，明確血必凈對(duì)膿毒癥早期大鼠下丘腦-垂體-腎上腺（HPA）軸及腎上腺組織GR mRNA的調(diào)節(jié)作用。
　　 方法：膿毒癥動(dòng)物

4、模型的制備選用經(jīng)典的盲腸結(jié)扎穿孔（CLP）法，并行頸靜脈置管以備采血。健康雄性Sprague-Dawley大鼠40只，隨機(jī)分為4組：①空白對(duì)照組（Normal group）：不給予任何處理，直接處死；②假手術(shù)組（Sham group）：只開(kāi)腹，翻動(dòng)腸管，牽拉盲腸，關(guān)腹，不結(jié)扎和穿孔盲腸；③氯化鈉組（NS group）：制模后即刻經(jīng)尾靜脈注射生理鹽水4ml/kg；④血必凈組（XBJ group）：制模后即刻經(jīng)尾靜脈注射血必凈4ml/kg。

5、各組術(shù)后在腹部皮下注射生理鹽水30ml/kg，補(bǔ)充術(shù)中丟失量和生理需要量。除空白對(duì)照組外，各組均于術(shù)后6小時(shí)經(jīng)頸靜脈取血3ml，離心后取血漿于-80℃凍存，放射免疫法測(cè)定血漿中ACTH、CORT的水平；并迅速留取下丘腦組織凍于液氮中，放射免疫法批量測(cè)定下丘腦組織勻漿中CRH的水平；各組留取腎上腺組織100mg，液氮保存，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain raction，RT

6、-PCR）半定量檢測(cè)GR mRNA在腎上腺中的表達(dá)水平。除正常對(duì)照組外，各組隨機(jī)取下丘腦、垂體和腎上腺組織制成1mm3大小，4％戊二醛固定，應(yīng)用透射電鏡觀察這些組織的超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS13.0版軟件包（SPSS Company，Chicago，Illinois，USA）進(jìn)行；數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，各組均數(shù)的比較行單因素方差分析（ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　

7、 結(jié)果：
　　 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物一般情況的觀察：假手術(shù)組大鼠術(shù)后清醒較快，活動(dòng)靈活，自由飲水，剖腹未見(jiàn)腹水，無(wú)惡臭。鹽水組動(dòng)物術(shù)后蘇醒延遲，精神萎靡，活動(dòng)遲緩，精神較差，豎毛，呼吸急促，剖腹可見(jiàn)淡血性腹水多，惡臭，腸管水腫，有的盲腸末端發(fā)黑。血必凈組動(dòng)物與鹽水組相比表現(xiàn)較輕。
　　 2下丘腦、垂體和腎上腺組織超微結(jié)構(gòu)變化：
　　 Sham組下丘腦室旁核胞質(zhì)較豐富，核染色質(zhì)疏松，核仁較明顯且偏位，胞質(zhì)內(nèi)粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量較

8、少，且排列紊亂，高爾基復(fù)合體位于核周，且扁平囊層次少，線粒體散在于胞質(zhì)中。NS組下丘腦超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為：粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，有脫顆?，F(xiàn)象；核仁較大；線粒體大部分嵴和膜融合消失，突觸前后膜模糊不清，突觸間隙模糊，部分融合消失，突觸前成分、小泡較少；線粒體大部分嵴和膜融合消失。XBJ組改變較NS組有明顯減輕。
　　 Sham組垂體ACTH細(xì)胞較大，外形不規(guī)則或呈星形，核大而圓，胞質(zhì)透亮，細(xì)胞器相對(duì)較少，高爾基復(fù)合體發(fā)達(dá)，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)較少，有

9、輕度擴(kuò)張，分泌顆粒較少。NS組垂體超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為：ACTH細(xì)胞不規(guī)則，可見(jiàn)較大的細(xì)胞核，細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量的內(nèi)分泌顆粒，橢圓形的致密芯，致密芯和膜之間有電子密度低的環(huán)形空暈；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有擴(kuò)張、脫顆?，F(xiàn)象，核糖體模糊不清；線粒體大部分嵴和膜融合、消失，有水腫、空化現(xiàn)象。而XBJ組ACTH細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)改變比NS組有明顯減輕。
　　 Sham組腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞內(nèi)充滿大小不一的脂滴，細(xì)胞質(zhì)中線粒體多，大部分的嵴呈空泡狀，基質(zhì)較透亮，滑

10、面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈空泡狀或呈分枝的管狀，脂質(zhì)中有大量糖原粒和游離的核糖體，高爾基復(fù)合體中等大小。NS組腎上腺超微結(jié)構(gòu)表現(xiàn)為：腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞細(xì)胞膜、核膜有融合現(xiàn)象，胞質(zhì)水腫?；鎯?nèi)質(zhì)網(wǎng)減少；線粒體水腫，局部空化，大部分管狀嵴融合消失，排列紊亂，線粒體部分雙層膜模糊不清，有的融合消失；脂滴減少；粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔膨脹，脫顆?，F(xiàn)象明顯。XBJ組的腎上腺皮質(zhì)束狀帶細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的變化比NS組有明顯減輕。
　　 3各組大鼠血漿CORT含量的比較：

11、鹽水組組血漿CORT含量（30.660±1.548ng/ml）明顯高于正常對(duì)照組（7.628±0.558ng/ml，P<0.01）及假手術(shù)組（11.853±0.871ng/ml，P<0.01）；血必凈組血漿CORT含量（22.131±1.458ng/ml）明顯低于鹽水組（P<0.01）；正常對(duì)照組與假手術(shù)組之間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 4各組大鼠血漿ACTH含量的比較：鹽水組血漿ACTH含量（26.260±1.6

12、34pg/ml）明顯高于正常對(duì)照組（8.841±1.393pg/ml.P<0.01）及假手術(shù)組（11.429±0.469pg/ml，P<0.01）；血必凈組血漿ACTH含量（26.260±1.634pg/ml）明顯低于鹽水組（P<0.01）；正常對(duì)照組與假手術(shù)組血漿ACTH含量相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 5各組大鼠下丘腦組織CRH含量的比較：鹽水組下丘腦組織勻漿中CRH含量（101.923±6.610ng/ml）明

13、顯高于正常對(duì)照組（61.653±6.051ng/ml，P<0.05）和假手術(shù)組（66.653±4.035ng/ml，P<0.05）：血必凈組下丘腦組織CRH含量（84.091±2.541ng/ml）明顯低于鹽水組（P<0.05）；正常對(duì)照組與假手術(shù)組下丘腦組織勻漿中CRH含量相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 6各組大鼠腎上腺組織GR mRNA表達(dá)水平變化：鹽水組腎上腺組織GR mRNA含量（10.799±0.113）明顯

14、低于正常對(duì)照組（1.420±0.068，P<0.01）和假手術(shù)組（1.150±0.108，P<0.01）；血必凈組腎上腺組織GR mRNA含量（0.922±0.107）和鹽水組之間相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）：正常對(duì)照組與假手術(shù)組腎上腺組織GR mRNA含量相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　　 結(jié)論：
　　 1本實(shí)驗(yàn)采用CLP法可成功復(fù)制由腹腔感染導(dǎo)致的膿毒癥大鼠動(dòng)物模型。
　　 2膿毒癥早期，血漿COR