外加磁場引導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向修復(fù)缺血心肌的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、干細(xì)胞移植是缺血性心臟病和心力衰竭富有潛力的治療手段，但移植細(xì)胞停留率低下嚴(yán)重制約了功能效應(yīng)的改善，因而提高移植細(xì)胞歸巢效率具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
　　本研究立足于細(xì)胞磁靶向研究的最前沿，對(duì)外加磁場引導(dǎo)下骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞靶向修復(fù)損傷心肌進(jìn)行了系統(tǒng)深入的研究。首先，在通過磁場物理學(xué)原理分析永磁鐵磁場特性的基礎(chǔ)上，對(duì)磁標(biāo)記MSCs的磁響應(yīng)性進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)磁標(biāo)記MSCs具有很強(qiáng)的磁響應(yīng)能力，在體外能夠被磁場大量捕獲，細(xì)胞捕獲率隨磁

2、場強(qiáng)度增強(qiáng)而增加，隨流速增加而減少，為磁靶向細(xì)胞移植的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供了理論依據(jù);其次，通過多模態(tài)影像學(xué)和染色體錯(cuò)配技術(shù)對(duì)順向冠脈注射MSCs治療大鼠心肌損傷進(jìn)行“磁場強(qiáng)度-療效”關(guān)系的研究，證實(shí)外加磁場以磁場強(qiáng)度依賴的方式增強(qiáng)MSCs的停留，首次發(fā)現(xiàn)過高的磁場強(qiáng)度并未帶來額外的心功能獲益，呈現(xiàn)“細(xì)胞停留-療效改善相分離”的矛盾現(xiàn)象，可能與永磁鐵的磁場強(qiáng)度呈現(xiàn)橫軸極化引發(fā)的細(xì)胞微栓塞有關(guān);最后，提出經(jīng)左頸內(nèi)靜脈插管進(jìn)行小動(dòng)物逆向冠脈注射細(xì)胞

3、的新方法，在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)外加磁場能夠促進(jìn)心梗大鼠逆向冠脈注射MSCs的停留、植入，進(jìn)一步減輕左室重塑和改善心功能，而且不存在細(xì)胞栓塞的風(fēng)險(xiǎn)。
　　研究結(jié)果顯示，細(xì)胞磁靶向治療有望成為促進(jìn)移植細(xì)胞歸巢的新興策略。
　　第一部分大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及磁化標(biāo)記
　　目的:確定超順磁性氧化鐵納米顆粒(SPIO)和DiR熒光染料標(biāo)記大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的合適方案。
　　方法:分離、培養(yǎng)和鑒定MSCs后，首

4、先用不同濃度的SPIO標(biāo)記MSCs24h，權(quán)衡標(biāo)記效率（普魯士藍(lán)染色、細(xì)胞透射電鏡檢查）和標(biāo)記毒性確定合適的SPIO標(biāo)記方案;再以5μg/ml的DiR工作液分別標(biāo)記懸浮和貼壁狀態(tài)MSCs，以DAPI標(biāo)記細(xì)胞核，通過熒光顯微鏡觀察標(biāo)記效率，確定DiR的有效標(biāo)記濃度。
　　結(jié)果:(1)25，50，100μg/ml的SPIO培養(yǎng)液對(duì)MSCs的標(biāo)記效率均接近100％(P＞0.05)，但是SPIO濃度由25μg/ml增加到50μg/ml時(shí)，

5、可見較多藍(lán)染鐵顆粒黏附于細(xì)胞表面，少數(shù)游離于細(xì)胞外;當(dāng)培養(yǎng)液SPIO濃度進(jìn)一步增加到100μg/ml時(shí)，較多鐵顆粒游離出細(xì)胞外，而且出現(xiàn)少數(shù)細(xì)胞溶解。以“25:0.75μg/mlSPIO-PLL24h方案”標(biāo)記MSCs，電鏡檢查顯示胞質(zhì)內(nèi)有含鐵致密顆粒囊泡，細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)未見破壞。(2)依據(jù)熒光顯微鏡觀察顯示DiR標(biāo)記MSCs的效率接近100％，確定“5μg/ml的DiR工作液”能夠有效標(biāo)記MSCs。
　　結(jié)論:權(quán)衡標(biāo)記效率和標(biāo)記毒

6、性，確定“25:0.75μg/ml SPIO-PLL24h標(biāo)記方案”和“5μg/ml DiR工作液”可高效、安全標(biāo)記大鼠MSCs。
　　第二部分永磁鐵的磁場特性和磁標(biāo)記間充質(zhì)干細(xì)胞的體外磁響應(yīng)性研究
　　目的:闡明圓柱體永磁鐵的磁場特性，明確體外靜態(tài)及流態(tài)磁標(biāo)記MSCs的磁響應(yīng)能力。
　　方法:對(duì)永磁鐵的磁場特性進(jìn)行磁場物理學(xué)分析;對(duì)靜態(tài)磁標(biāo)記MSCs施加0.21 T的環(huán)形磁鐵，通過磁共振成像及倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞在

7、磁場中的再分布;1×106磁標(biāo)記MSCs以5mm/s流過一石英管，在中段管壁上分別放置0.15T、0.3 T和0.6T的磁鐵作為不同強(qiáng)度磁靶向組，對(duì)照組未放置磁鐵，通過計(jì)算細(xì)胞捕獲率觀察不同強(qiáng)度磁場對(duì)流態(tài)MSCs的捕獲效應(yīng);對(duì)0.6T磁靶向組分別設(shè)置4，20，100和500mm/s4種流速，觀察不同流速對(duì)0.6T磁鐵捕獲細(xì)胞的影響。
　　結(jié)果:通過磁場物理學(xué)分析得出永磁鐵的磁場沿z軸旋轉(zhuǎn)對(duì)稱，半徑(r)不變時(shí)，磁感應(yīng)強(qiáng)度隨z的增加

8、而減少;z不變時(shí)，磁感應(yīng)強(qiáng)度從中心(O)到圓柱體側(cè)面逐漸增大，在圓柱體側(cè)面磁感應(yīng)強(qiáng)度最大，r再繼續(xù)增大，磁感應(yīng)強(qiáng)度又逐漸減少。靜態(tài)磁標(biāo)記MSCs在磁場作用下重新分布，形成與磁鐵半徑對(duì)應(yīng)的棕色圓環(huán)，磁共振成像顯示環(huán)行信號(hào)缺失區(qū);0.15 T、0.3 T和0.6 T的磁鐵對(duì)流態(tài)磁標(biāo)記MSCs的捕獲率隨著磁鐵強(qiáng)度的增強(qiáng)而顯著提高（分別為44.67％±5.5％、68％±3％和80.3％±1.5％，組間比較P均＜0.05），對(duì)照組幾乎沒有細(xì)胞被捕

9、獲;當(dāng)流速為4、20、100和500 mm/s，0.6T磁鐵對(duì)磁標(biāo)記MSCs的捕獲率隨流速增加而顯著減少(分別為85.0％±3.6％、68.7％±4.7％、11.3％±4.5％和1.6％±0.75％，P均＜0.01)，磁標(biāo)記MSCs在磁場中的捕獲率與流速（(v)）呈負(fù)相關(guān)(R=-0.770; P=0.003)。
　　結(jié)論:磁標(biāo)記MSCs具有很強(qiáng)的磁響應(yīng)能力，在靜態(tài)和流態(tài)情況下能夠被磁場大量捕獲;細(xì)胞捕獲率隨磁場強(qiáng)度增強(qiáng)而增加，隨流

10、速增加而減少;磁標(biāo)記MSCs在磁場作用下呈橫向極化分布，由此引起了我們對(duì)磁靶向干細(xì)胞移植可能導(dǎo)致或加重微栓塞的擔(dān)憂。
　　第三部分外加磁場引導(dǎo)下經(jīng)冠狀動(dòng)脈順向移植間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠缺血心肌的研究
　　目的:為了觀察外加磁場對(duì)在體移植細(xì)胞的靶向停留效果，我們進(jìn)行了不同強(qiáng)度磁場下經(jīng)冠狀動(dòng)脈注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞治療缺血再灌注大鼠的實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法:將雌性SD大鼠建立缺血再灌注模型后隨機(jī)分為5組，每組25只:(1)PBS

11、組:左室內(nèi)注射PBS;(2)0T組:左室內(nèi)注射MSCs，未行磁靶向;(3)0.15T組:左室內(nèi)注射MSCs，使用0.15T的磁鐵實(shí)施磁靶向;(4)0.3 T組:左室內(nèi)注射MSCs，使用0.3 T的磁鐵實(shí)施磁靶向;(5)0.6 T組:左室內(nèi)注射MSCs，使用0.6T的磁鐵實(shí)施磁靶向。所有注射的MSCs均取自雄性SD大鼠，細(xì)胞量為1×106，均標(biāo)記SPIO和DiR，注射期間阻斷主、肺動(dòng)脈5秒，對(duì)3個(gè)磁靶向組分別緊貼靶病變部位處(控制距離0-

12、1mm)放置0.15T，0.3 T和0.6 T磁鐵自注射開始持續(xù)至注射后10分鐘。通過離體心臟熒光成像和定量PCR檢測雄性MSCs的SRY基因來評(píng)估停留細(xì)胞量，通過組織形態(tài)學(xué)和心超檢測評(píng)估心臟的功能學(xué)效應(yīng)。
　　結(jié)果:注射后24小時(shí)，SRY基因的RT-PCR檢測結(jié)果顯示0.15T、0.3 T和0.6T組的細(xì)胞停留率分別是0T組的1.45倍、2.76倍和3.86倍（分別為3.75％±0.44％、7.13％±0.28％、9.95％±0

13、.53％和2.58％±0.58％，組間比較P均＜0.001），而且磁場強(qiáng)度與細(xì)胞停留量之間呈現(xiàn)正相關(guān)(R=0.983，P=0.017)。將PBS組作為陰性對(duì)照，在細(xì)胞移植后24小時(shí)，對(duì)大鼠心臟進(jìn)行熒光成像，3個(gè)磁靶向組大鼠心臟均探測到比0T組更強(qiáng)的紅色熒光（P均＜0.001），其中0.6 T組的熒光信號(hào)最強(qiáng)，0.3 T組次之，0.15 T組最弱，同RT-PCR的檢測結(jié)果一致。在細(xì)胞移植后3周，與0T組比較，RT-PCR結(jié)果顯示0.15

14、T組和0.3 T組移植細(xì)胞植入均顯著增多;組織形態(tài)學(xué)分析和心超結(jié)果顯示左室重塑明顯減弱和左室功能顯著改善，尤以0.3 T組的治療效應(yīng)最強(qiáng)。然而，由于大量微血管栓塞，雖然0.6 T組細(xì)胞停留率最高，但治療效應(yīng)與0T組無顯著差別。
　　結(jié)論:順向冠脈移植時(shí)，外加磁場以磁場強(qiáng)度依賴的方式增強(qiáng)MSCs的停留，進(jìn)而得到心臟的功能學(xué)獲益，但過高的磁場強(qiáng)度則有加重微栓塞的風(fēng)險(xiǎn)，因而并未帶來額外的心功能獲益，導(dǎo)致“細(xì)胞停留-療效改善相分離”的矛盾

15、現(xiàn)象。
　　第四部分外加磁場引導(dǎo)下經(jīng)冠狀靜脈逆向移植間充質(zhì)干細(xì)胞治療大鼠缺血心肌的研究
　　目的:為了探索磁靶向能否增強(qiáng)逆向冠脈注射細(xì)胞的停留，我們對(duì)心梗大鼠進(jìn)行了外加磁場引導(dǎo)下逆向冠脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)研究。
　　方法:使用雌性SD大鼠建立急性心梗模型，選用前端塑形導(dǎo)絲插入左頸內(nèi)靜脈至左側(cè)冠狀靜脈，再用一導(dǎo)管沿導(dǎo)絲送達(dá)左冠狀靜脈近中段，對(duì)心梗大鼠逆向冠脈注射1×106 MSCs，在注射期間及注射后10分鐘緊貼心臟

16、表面放置0.6 T的磁鐵，通過SRY基因的RT-PCR檢測、心臟磁共振和離體心臟熒光成像等多模態(tài)影像學(xué)檢查來評(píng)估心臟停留細(xì)胞量，通過組織形態(tài)學(xué)和心超檢測評(píng)估心臟的功能學(xué)效應(yīng)。
　　結(jié)果:注射后24小時(shí)，心臟磁共振成像半定量分析顯示磁靶向組大鼠左室前壁的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度低于無磁靶向組（0.61％±0.06％ vs0.88％±0.08％，P＜0.01），心臟離體熒光成像顯示，磁靶向組熒光信號(hào)是無磁靶向組的2.73倍（26222±5102v