志賀氏菌多克隆、單克隆及基因工程抗體的制備與免疫層析試紙條的初步研制.pdf

1、志賀氏菌又稱痢疾桿菌，是引發(fā)我國感染性腹瀉、嚴重危害人類健康的食源性致病菌。它主要侵害結(jié)腸，引發(fā)潰瘍、粘液性血性腹瀉，對嬰幼兒有較高的感染率和死亡率。加強對志賀氏菌的監(jiān)測，有助于預(yù)防和控制大規(guī)模感染疫情的爆發(fā)。目前，針對食源性致病菌的檢測方法主要有傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)、PCR檢測和免疫學(xué)方法等。免疫學(xué)方法因其簡單、快速、成本低廉等優(yōu)點而備受青睞。本文旨在制備多種抗志賀氏菌的抗體，建立一種快速、簡便篩查志賀氏菌的膠體金免疫試紙條檢測方法，用于其

2、臨床診斷及食品衛(wèi)生監(jiān)測。
　　 采用志賀氏菌混合菌體碎片作為免疫原免疫家兔，制備獲得了效價為1∶1280000的抗血清。經(jīng)菌體逆向吸附法和辛酸硫酸銨沉淀法純化后，有效去除了與大腸桿菌和阪崎腸桿菌等雜菌的交叉反應(yīng)，獲得了抗志賀氏菌的多克隆抗體。通過細胞融合技術(shù)，篩選得到4株能穩(wěn)定分泌抗志賀氏菌單克隆抗體的雜交瘤細胞株。采用辛酸硫酸銨沉淀法對單克隆細胞株4G9的腹水進行純化，獲得單克隆抗體，可與純化多抗配對使用。用膠體金標(biāo)記單克隆抗

3、體，將多克隆抗體和驢抗鼠IgG分別噴涂于硝酸纖維素膜作為檢測線和質(zhì)控線，制備了志賀氏菌的膠體金免疫層析試紙條。檢測志賀氏菌純培養(yǎng)物的靈敏度為105 CFU/mL;在添加108 CFU/mL的長雙歧桿菌和阪崎腸桿菌的干擾下，其牛奶樣品中的志賀氏菌的靈敏度為106 CFU/mL。
　　 本文從制備的志賀氏菌單抗細胞株4G9中獲得了VL、VH基因的序列，發(fā)現(xiàn)其分別屬于κ鏈和γ鏈。由于VL經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)存在終止密碼子，因此只把VH分別構(gòu)建到