RNAi下調(diào)NR2E1的表達(dá)抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長與集落形成.pdf

1、背景與目的:細(xì)胞核受體是一類配體依賴型的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，通過募集正向和負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白來控制一些關(guān)鍵的生物學(xué)效應(yīng)，在胚胎的生長、發(fā)育、分化中起重要作用。NR2E1基因?qū)儆诩?xì)胞核受體中的孤兒核受體轉(zhuǎn)錄因子家族，定位于人類第6條染色體6q21-22上。首先在脊椎動物前腦中發(fā)現(xiàn)和鑒定，并且在成人腦中高表達(dá)。從果蠅至人類都高度保守。它被認(rèn)為在胚胎發(fā)育期和成人腦中維持神經(jīng)干細(xì)胞未分化狀態(tài)和增殖能力中起著重要作用。目前有研究表明NR2E1基因通過招募組蛋

2、白脫乙?；D(zhuǎn)移酶(HDACs)抑制下游基因如P21，PTEN的表達(dá)從而調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖和分化;去甲基化酶LSD1和NR2E1相互作用，結(jié)合至PTEN啟動子上，抑制PTEN基因的表達(dá);激活Wnt/β-catenin通路，并在表皮生長因子(EGF)和成纖維細(xì)胞生長因子(FGF)存在條件下，Wnt/β-catenin通路反饋調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞;微小RNA-9能抑制NR2E1基因的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其分化。類似上述P21，P

3、TEN等腫瘤抑制基因和細(xì)胞周期因子因其在維持正常的物質(zhì)代謝和內(nèi)環(huán)境自穩(wěn)態(tài)及腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要地位，被作為癌癥治療的重要靶點(diǎn)和候選基因。而NR2E1基因作為神經(jīng)干細(xì)胞增殖和自我更新的調(diào)節(jié)者與被調(diào)節(jié)者，在細(xì)胞周期蛋白和抑癌基因調(diào)控上具有重要意義，在多種生物學(xué)功能中發(fā)揮重要作用。然而迄今為止，NR2E1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的關(guān)系尚未得到研究，其在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能作用及機(jī)制也有待闡明。為此我們設(shè)計了針對NR2E1基因的siRNA靶點(diǎn)序列，包裝表達(dá)N

4、R2E1 siRNA的重組慢病毒，感染膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞，特異性沉默細(xì)胞內(nèi)的NR2E1基因，并檢測基因沉默后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞生長，細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡的變化。而后，通過定量RT-PCR來評價P21，PTEN和細(xì)胞周期蛋白D1的基因表達(dá)。希望通過對該基因的研究幫助理解膠質(zhì)瘤發(fā)生的分子基礎(chǔ)并進(jìn)一步開展分子機(jī)制和病理相關(guān)性的研究，以期更好的開發(fā)其臨床應(yīng)用價值，為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)與方法。
　　方法:構(gòu)建靶向NR2E1基因的

5、RNAi慢病毒載體，包裝攜帶NR2E1 siRNA的重組慢病毒，感染膠質(zhì)瘤U251和U87細(xì)胞;感染5天后，實(shí)時熒光定量PCR和Western blot檢測NR2E1基因的表達(dá)水平;通過MTT，BrdU摻入實(shí)驗(yàn)和克隆形成實(shí)驗(yàn)研究NR2E1基因?qū)δz質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和體外成瘤能力的影響;流式細(xì)胞儀觀察NR2E1基因沉默后，細(xì)胞周期的改變。實(shí)時熒光定量PCR檢測下游基因P21，PTEN和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)。
　　結(jié)果:感染表達(dá)NR2E1

6、 siRNA的慢病毒72小時后，80％以上的U251細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白GFP，提示本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)感染率高且穩(wěn)定。實(shí)時熒光定量PCR和Western blot結(jié)果顯示感染NR2E1-RNAi-Lentivirus的U251細(xì)胞中，NR2E1mRNA和蛋白水平顯著降低(P＜0.05)。
　　MTT和BrdU實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，感染NR2E1-RNAi-Lentivirus的U251和U87細(xì)胞的增殖能力顯著降低，DNA的合成量顯著減少;下調(diào)N

7、R2E1表達(dá)可以顯著地抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和DNA合成(P＜0.05)。
　　用FACS流式細(xì)胞儀測定NR2E1-RNAi載體對U251細(xì)胞周期和凋亡的影響，顯示感染NR2E1-RNAi-Lentivirus后，處于G1和G2期的細(xì)胞百分比明顯減少，而S期的細(xì)胞顯著增多(P＜0.05)。
　　克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NR2E1下調(diào)可顯著抑制U251細(xì)胞的體外成瘤能力。
　　通過RT-PCR檢測了NR2E1相關(guān)基因P21，

8、PTEN和細(xì)胞周期蛋白D1的mRNA表達(dá)水平，與感染陰性對照病毒的細(xì)胞相比，感染NR2E1-RNAi-Lentivirus的細(xì)胞中P21，PTEN和細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)水平都顯著降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論:本研究發(fā)現(xiàn)，慢病毒介導(dǎo)的NR2E1基因表達(dá)下調(diào)可有效的抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖以及體外成瘤能力。與感染陰性對照病毒的細(xì)胞相比，在NR2E1下調(diào)的細(xì)胞中，P21，PTEN和細(xì)胞周期蛋白D1的表達(dá)水平顯著下降。結(jié)果表明NR2E1對于