桃潛隱花葉類病毒分子變異的研究.pdf

1、桃潛隱花葉類病毒(PLMVd)的危害是影響桃產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，在許多國家已被確定為最危險的系統(tǒng)侵染性病原之一，但該類病毒在國內(nèi)研究很少。本研究從PLMVd的檢測入手，研究建立了PLMvd的檢測技術(shù)；克隆了中國分離物的全長核苷酸序列，并進行了分子特性分析；然后通過對單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析技術(shù)(SSCP)改進，對PLMVd的分子組成(即群體結(jié)構(gòu))和分子變異進行了研究，并對不同分離物致病性差異的分子機制進行了初步分析。最后，還鑒定了PLMVd

2、 cDNA在SSCP中所產(chǎn)生的兩條單鏈極性。 (1)采用反轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法對春、夏季從武漢地區(qū)采集的感染PLMVd的桃樣品進行分析，結(jié)果顯示，春季采集的5個樣品(P1-P5)獲得了預(yù)期大小約為337 bp的目標(biāo)擴增條帶，而夏季采集的樣品，通過去蛋白純化處理后，獲得了預(yù)期的目標(biāo)擴增條帶。通過回收RT-PCR產(chǎn)物，用生物素標(biāo)記制備探針，分別采用DNA斑點雜交、RNA斑點雜交和組織印跡雜交三種雜交方法對這些樣品

3、進行了檢測，結(jié)果顯示三種雜交方法均可檢測到PLMVd，其中組織印跡雜交與DNA斑點雜交的雜交信號較強，RNA斑點雜交信號較弱。此外，還運用雙向電泳進行了檢測分析，結(jié)果顯示有一條落后于連續(xù)電泳帶之外的核酸帶。 采用組織印跡雜交方法分析了PLMVd在桃樹不同部位(皮、嫩梢、幼果、顯癥和不顯癥嫩葉、顯癥和不顯癥老葉)的分布情況。結(jié)果顯示，除皮外，PLMVd在這些部位均有分布，且類病毒含量之間的差異較小。 (2)測定顯示PLMV

4、d中國分離物分子變種PLMVd-P3的cDNA分子全長為337 nt，與已報道的PLMVd基因組大小相似。序列分析表明，該分子變種與已報道的不同變種相似性為90％-96％。對獲得的不同分離物的分子變異發(fā)生位置進行了分析，結(jié)果顯示變異主要集中在錘頭臂，LooP A，PSTI臂和大部分單鏈區(qū)，而從140到270 nt處，包括P4到P10區(qū)，則很少發(fā)生變異。用軟件分析各分子變種的二級結(jié)構(gòu)顯示，它們都顯示為一個包含中心區(qū)和幾個莖的多分枝狀二級結(jié)

5、構(gòu)，但各分子變種之間結(jié)構(gòu)差異很大，除了都存在與經(jīng)典的二級結(jié)構(gòu)相應(yīng)的P1、P9、P10和P11莖外，其它P2-P8莖則相互表現(xiàn)為不同組合，從而形成幾種不同的二級結(jié)構(gòu)。 (3)選用8個已經(jīng)測序、相互之間有1-25個堿基差異的克隆為材料，進行了單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析(SSCP)。結(jié)果顯示，采用報道的SSCP分析，不同克隆間表現(xiàn)出相同的SSCP帶型，顯示出現(xiàn)有SSCP技術(shù)靈敏度很低。通過電壓、膠濃度、膠交聯(lián)度、電泳時間等條件的優(yōu)化后，其中6

6、個克隆可以被鑒定出來。而在一種改進型SSCP凝膠上，其由不同交聯(lián)度(49：1和29：1)的上下兩半部分8％聚丙烯酰胺組成，則能夠?qū)⑺写嬖诜肿硬町惖目寺⊥耆珔^(qū)分開。對來源于同一分離物的22個克隆運用了以上SSCP方法進行了分析，所顯示的靈敏度與分析8個克隆時一致。對比分析SSCP圖譜與克隆間的序列差異關(guān)系，序列間堿基差異的多少和它們的SSCP帶型相對位置差異不存在相關(guān)性，說明影響eDNA單鏈條帶遷移距離的因素除了和堿基差異的數(shù)量有關(guān)外，

7、主要和變異發(fā)生位置有關(guān)。 (4)運用改進的SSCP技術(shù)，對表現(xiàn)PLMVd三種典型癥狀(葉片褪綠、花葉和黃化)的不同來源的6個桃樣品進行了PLMVd分子變異分析。結(jié)果顯示，PLMVd的每個分離物由不同的分子變種組成，其中有一個優(yōu)勢分子變種，占32％-57％，其他大部分分子變種的比例都很低，約4％-5％，但非優(yōu)勢分子變種總量較大，為43％-68％。通過對6個分離物的分子變種的序列分析結(jié)果顯示，優(yōu)勢分子變種和不同的非優(yōu)勢分子變種序列間

8、差異很小，僅有1-6個堿基的變化，相似性高達98.5％-99.7％。將優(yōu)勢序列和采用生物學(xué)軟件對不同序列推導(dǎo)產(chǎn)生的共有序列對比，結(jié)果顯示，在每個群體中，優(yōu)勢分子變種序列和共有序列完全一致。表明在一個群體內(nèi)，優(yōu)勢分子變種具有對其它分子變種的廣泛代表性。 通過對不同分離物的優(yōu)勢序列相似性及遺傳距離分析表明，生物學(xué)表現(xiàn)一致的分離物之間，都表現(xiàn)出較高相似性和較小遺傳距離，分別為98.8％以上和小于1％；而不同生物學(xué)表現(xiàn)的分離物間，則表現(xiàn)

9、出較低相似性和較大的遺傳距離，分別為98.5％以下和大于1％。 分析分離物間的變異特點顯示，寄主癥狀表現(xiàn)相同的分離物間存在一些獨特的堿基變異。在葉緣褪綠癥狀分離物核苷酸序列上，在169 nt處存在變異G或U；黃化癥狀的分離物中，在115和116 nt處存在兩個變異堿基CU；花葉癥狀分離物中則存在變異(3 nt：缺失C、5 nt：A和54 nt：U)。 (5)利用不對稱PCR-SSCP對PLMVd在SSCP中所產(chǎn)生的兩條單