β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TRIF)在NOD小鼠1型糖尿病發(fā)病中的作用.pdf

1、第一部分TRIF對NOD小鼠T1D發(fā)病的影響
　　目的:
　　(1)研究TRIF在NOD小鼠T1D發(fā)病中的作用;
　　(2)探明TRIF對NOD小鼠胰島功能的影響。
　　方法:
　　以野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠為研究對象。(1)通過尿糖檢測，觀察野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠自發(fā)性T1D的發(fā)病率;(2)通過過繼轉(zhuǎn)移年齡、性別、糖尿病病程匹配的野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD

2、小鼠的脾細(xì)胞至三種不同的受試小鼠（包括半致死劑量照射的NOD小鼠，半致死劑量照射的TRIF-/-NOD小鼠和NOD.SCID小鼠），觀察誘導(dǎo)性T1D的發(fā)病率;(3)采用Luminex法檢測非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠血清中的抗胰島素抗體;(4)采用經(jīng)腹腔糖耐量實驗（IPGTT）評價非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠的糖耐量，放射免疫法測定IPGTT各時間點血清中胰島素水平;(5)采用體外葡萄糖刺激實

3、驗評價非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠的胰島在糖刺激下胰島素的分泌水平，放射免疫法測定胰島素水平;(6)通過胰腺HE染色切片觀察非糖尿病野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠胰島淋巴細(xì)胞的浸潤，進行胰島炎評分。
　　結(jié)果:
　　(1)雌性TRIF-/-NOD小鼠(n=10)自發(fā)性T1D發(fā)病率低于野生型NOD小鼠(n=15);雄性TRIF-/-NOD小鼠(n=12)自發(fā)性T1D發(fā)病率低于TRIF+/-NO

4、D小鼠(n=17)。
　　(2)過繼轉(zhuǎn)移模型中，接受了糖尿病TRIF-/-NOD小鼠脾細(xì)胞的三種不同的受試小鼠（包括半致死劑量照射的NOD小鼠，半致死劑量照射的TRIF-/-NOD小鼠和NOD.SCID小鼠）誘導(dǎo)性T1D發(fā)病顯著延遲(P＜0.01-0.05)。
　　(3)雌性TRIF-/-NOD小鼠血清中抗胰島素抗體陽性率顯著低于野生型NOD小鼠（P＜0.05）。
　　(4) IPGTT提示TRIF-/-NOD小鼠糖耐

5、量未受損(P＜0.01)，血清中胰島素水平顯著高于野生型NOD小鼠(P＜0.05)。
　　(5)體外葡萄糖刺激實驗提示TRIF-/-NOD小鼠的胰島在糖刺激下胰島素分泌水平顯著高于野生型NOD小鼠(P＜0.05)。
　　(6) TRIF-/-NOD小鼠浸潤胰島的淋巴細(xì)胞明顯少于野生型NOD小鼠(P＜0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1) TRIF在NOD小鼠T1D發(fā)病中起重要作用，TRIF缺陷導(dǎo)致T1D發(fā)病延遲。<

6、br>　　(2) TRIF可通過促進胰島炎的發(fā)生，增加胰島β細(xì)胞免疫性損傷而降低胰島β細(xì)胞功能。
　　關(guān)鍵詞:TRIF;1型糖尿病;β細(xì)胞功能;胰島炎
　　第二部分TRIF對NOD小鼠免疫細(xì)胞表型的影響
　　目的:
　　研究TRIF對NOD小鼠抗原遞呈細(xì)胞(APCs)和T細(xì)胞表型的影響。
　　方法:
　　以12周齡雌性非糖尿病的野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠為研究對象。(1)獲取非糖尿病野

7、生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾和胰腺淋巴結(jié)(PLN)中的淋巴細(xì)胞，浸潤胰島的淋巴細(xì)胞，骨髓來源的細(xì)胞，磁珠分離純化脾APCs;(2)脾淋巴細(xì)胞，脾APCs和骨髓來源的細(xì)胞分別以未加任何刺激物、加有TLR3激動劑PolyI∶C及加有TLR4激動劑LPS的RPMI1640完全培養(yǎng)基懸浮并刺激過夜，次日洗滌待用;(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)記物，細(xì)胞內(nèi)炎性因子及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例。
　　結(jié)果:
　　(1)與野生型NO

8、D小鼠相比，TRIF-/-NOD小鼠脾B細(xì)胞，脾單核巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DCs)表面MHCⅡ類分子(IAK)的表達明顯降低（脾B細(xì)胞:PolyI∶C刺激后P＜0.01，LPS刺激后P＜0.05，抗CD40單克隆抗體刺激后P＜0.05;脾單核巨噬細(xì)胞和DCs:未加刺激物P＜0.05，PolyI∶C刺激后P＜0.05，LPS刺激后P＜0.05）;與野生型NOD小鼠相比，TRIF-/-NOD小鼠胰島DCs表面IAK的表達亦明顯降低(P＜0.

9、001)。
　　(2)與野生型NOD小鼠相比，脾臟B細(xì)胞表面的CD86的表達明顯下降（未加刺激物P＜0.05，PolyI∶C刺激后P＜0.001，LPS刺激后P＜0.001）;TRIF-/-NOD小鼠脾單核巨噬細(xì)胞表面CD80的表達下降（未加刺激物P＜0.05，LPS刺激后P＜0.05），CD86的表達在PolyI∶C和LPS刺激后明顯下降（PolyI∶C刺激后P＜0.001，LPS刺激后P＜0.01）;脾臟DCs表面CD86的表

10、達在PolyI∶C和LPS刺激后明顯下降(PolyI∶C刺激后P＜0.001，LPS刺激后P＜0.01)。與野生型NOD小鼠相比，TRIF-/-NOD小鼠胰島單核巨噬細(xì)胞表面CD80和CD86的表達均出現(xiàn)了明顯下降（P均＜0.05）;而骨髓來源的單核巨噬細(xì)胞和DCs表面CD86的表達在PolyI∶C和LPS刺激后明顯下降(PolyI∶C刺激后P均＜0.001，LPS刺激后P均＜0.001)。
　　(3)與野生型NOD小鼠相比，TR

11、IF-/-NOD小鼠脾臟單核巨噬細(xì)胞和DCs分泌的TNF-α水平尤其在PolyI∶C和LPS刺激后明顯減少（單核巨噬細(xì)胞:PolyI∶C刺激后P＜0.05，LPS刺激后P=0.06; DCs:未加刺激物P＜0.05，PolyI∶C刺激后P＜0.01，LPS刺激后P＜0.01）。與野生型NOD小鼠相比，TRIF-/-NOD小鼠脾臟單核巨噬細(xì)胞和DCs分泌的IFN-γ水平亦明顯減少（單核巨噬細(xì)胞:未加刺激物P＜0.05，PolyI∶C刺激后

12、P＜0.001，LPS刺激后P＜0.01;DCs:未加刺激物P＜0.01，PolyI∶C刺激后P＜0.001，LPS刺激后P＜0.001）。
　　(4)與野生型NOD小鼠相比，TRIF-/-NOD小鼠骨髓來源的單核巨噬細(xì)胞和DCs表面CCR7的表達在PolyI∶C和LPS刺激后明顯降低（單核巨噬細(xì)胞:未加刺激物P＜0.05，PolyI∶C刺激后P=0.06，LPS刺激后P＜0.01; DCs: PolyI∶C刺激后P＜0.01，L

13、PS刺激后P＜0.05)。
　　(5)與野生型NOD小鼠相比，TRIF-ANOD小鼠脾，PLN及胰島中CD4+T細(xì)胞表面CD69的表達明顯降低（脾:P＜0.05; PLN:P＜0.05;胰島:P＜0.001）;TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T細(xì)胞表面ICOS和CD40L的表達也明顯降低（P均＜0.05）。
　　(6)與野生型NOD小鼠相比，TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T細(xì)胞所分泌的TNF-α，IFN-γ及IL-17

14、尤其是在PolyI∶C和LPS刺激后明顯降低（TNF-α:未加刺激物P＜0.01;IFN-γ:未加刺激物P＜0.05，PolyI∶C刺激后P＜0.05; IL-17:未加刺激物P＜0.05，LPS刺激后P＜0.001)。
　　結(jié)論:
　　TRIF影響APCs表面MHCⅡ類分子和共刺激分子的表達及炎性因子的分泌，影響T細(xì)胞尤其是CD4+T細(xì)胞表面活化因子的表達和其炎性因子的分泌。
　　關(guān)鍵詞:TRIF;樹突狀細(xì)胞;MHC

15、Ⅱ類分子;共刺激表達分子;T細(xì)胞活化
　　第三部分TRIF對NOD小鼠免疫細(xì)胞功能的影響
　　目的:
　　研究TRIF對NOD小鼠APCs和T細(xì)胞功能的影響。
　　方法:
　　以12周齡雌性非糖尿病的野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠為研究對象。(1)過繼轉(zhuǎn)移野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠骨髓中的單個核細(xì)胞分別給致死X線劑量照射過的TRIF-/-NOD小鼠和野生型NOD小鼠進行骨髓嵌合實

16、驗，觀察T1D的發(fā)病率;(2)磁珠分離純化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T細(xì)胞及NY8.3NOD小鼠的脾CD8+T細(xì)胞分別與野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾APCs，在不同濃度的mimotope和IGRP刺激下共培養(yǎng)，進行體外增殖實驗，比較兩組小鼠APCs的體外抗原遞呈能力;(3)磁珠分離純化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T細(xì)胞，CFSE標(biāo)記后，靜脈注射給野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠，三天后

17、處死小鼠獲取脾臟和PLN，流式檢測BDC2.5 CD4+細(xì)胞CFSE的衰減，比較兩組小鼠APCs的抗原遞呈能力;(4)磁珠分離純化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T細(xì)胞與野生型NOD小鼠或TRIF-/-NOD小鼠脾APCs一起過繼轉(zhuǎn)移給NOD.SCID小鼠，觀察T1D發(fā)病率，比較兩組小鼠APCs的體內(nèi)抗原遞呈能力;(5)磁珠分離純化得到的BDC2.5NOD小鼠的脾CD4+T細(xì)胞與不同刺激狀態(tài)的骨髓源性的DCs(BMDCs)細(xì)胞在

18、不同濃度的mimotope刺激下共培養(yǎng)，進行體外增殖實驗，比較兩組小鼠BMDCs的體外抗原遞呈能力;(6)磁珠分離純化得到野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，與NOD小鼠的脾細(xì)胞在不同濃度的抗CD3抗體刺激下共培養(yǎng)，進行體外增殖實驗，比較兩組小鼠T細(xì)胞的體外增殖能力;(7)磁珠分離純化得到野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠脾CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞，兩兩組合后一起過繼轉(zhuǎn)移給NOD.S

19、CID小鼠，觀察T1D發(fā)病率，比較兩組小鼠T細(xì)胞的體內(nèi)增殖和致病能力。
　　結(jié)果:
　　(1)骨髓嵌合實驗中，供體小鼠為野生型NOD小鼠，受試小鼠為接受致死劑量X線照射的TRIF-/-NOD小鼠T1D發(fā)病早于供體小鼠為TRIF-/-NOD小鼠，受試小鼠為接受致死劑量X線照射的野生型NOD小鼠(P＜0.05)。
　　(2)野生型NOD小鼠和TRIF-/-NOD小鼠的APCs在不同濃度IGRP刺激下對NY8.3 CD8+T

20、細(xì)胞的抗原遞呈能力相似(P＞0.05);但TRIF-/-NOD小鼠的APCs在10ng/ml(P＜0.05)和100ng/ml(P＜0.001)mimotope刺激下對BDC2.5 CD4+T細(xì)胞的抗原遞呈能力明顯弱于野生型NOD小鼠的APCs。
　　(3)CSFE標(biāo)記的BDC2.5 CD4+T細(xì)胞在TRIF-/-NOD小鼠脾臟和PLN中增殖強度弱于野生型NOD小鼠。
　　(4)過繼轉(zhuǎn)移實驗中，接受BDC2.5 CD4+T細(xì)

21、胞和TRIF-/-APCs的NOD.SCID小鼠T1D發(fā)病慢于接受BDC2.5 CD4+T細(xì)胞和NODAPCs的NOD.SCID小鼠。
　　(5) TRIF-/-NOD小鼠不同刺激狀態(tài)下BMDCs的體外抗原遞呈能力明顯弱于野生型NOD小鼠（未加刺激物P＜0.05，PolyI∶C刺激后P＜0.05，LPS刺激后P＜0.01）。
　　(6) TRIF-/-NOD小鼠CD8+T細(xì)胞的體外增殖與NOD小鼠無差異;而TRIF-/-NO

22、D小鼠CD4+T細(xì)胞的增殖明顯少于NOD小鼠(P＜0.001-0.05)。
　　(7)過繼轉(zhuǎn)移實驗中，發(fā)病最快的是接受NOD CD4+T細(xì)胞及NOD CD8+T細(xì)胞的NOD.SCID小鼠，其次是接受NOD CD4+T細(xì)胞及TRIF-/-CD8+T細(xì)胞的NOD.SCID小鼠，再次是接受TRIF-/-CD4+T細(xì)胞及NOD CD8+T細(xì)胞的NOD.SCID小鼠，發(fā)病最慢、糖尿病發(fā)病率最低的是接受TRIF-/-CD4+T細(xì)胞及TRIF-