Sca-1，CD24和Muc1在大鼠乳腺發(fā)育期分布的研究.pdf

1、背景和目的 哺乳動物的乳腺是一種復管泡狀腺，具有分泌乳汁的功能；是動物出生后唯一可以多次重復再生的器官。根據(jù)乳腺發(fā)育的特征，嚙齒類動物乳腺大致可以分為六個發(fā)育期：胚胎期、青春期、性成熟期、孕期、哺乳期和退化期。 在乳腺細胞分化過程中，往往由于高度分化而完全失去再生能力，最終導致細胞的衰老死亡；乳腺在發(fā)育進化過程中為了補償這一不足，保留了一部分未分化的原始細胞，稱為乳腺干細胞。 乳腺細胞的增殖和分化始終貫穿于乳腺發(fā)

2、育及泌乳全過程，人們在細胞水平上進行了大量的乳腺上皮細胞增殖及分化的研究。這些研究揭示乳腺干細胞再生乳腺和分化異常導致乳腺癌變的機制，為乳腺腫瘤和癌癥預防及治療提供理論依據(jù)，為研究器官形成和細胞分化機理提供合適的模型。 乳腺干細胞研究的標記蛋白主要有CK5，Sca-1，α6-integrin，MUC<'->/ESA<'+>以及CK19。 合適的乳腺干細胞特殊標記物的討論仍在進行。在各報道中所確定的鑒別乳腺干細胞的標記物不

3、同，這是值得重視和進一步研究的現(xiàn)象。這種不同可能有多方面的原因：1．材料的來源不同；2．體內(nèi)和體外培養(yǎng)研究方法的不同；3．乳腺干細胞及其微環(huán)境隨著個體的發(fā)育也處于發(fā)育變化過程中；4．乳腺干細胞在建立復雜的調(diào)控機制、信號轉(zhuǎn)導系統(tǒng)和特殊功能過程中表達一系列相關(guān)的蛋白。我們選取青春期、性成熟期、孕期、哺乳期的大鼠乳腺組織進行形態(tài)學研究，運用免疫熒光和免疫酶標記以及Western免疫印跡法，觀察Sca-1，CD24，Mucl在大鼠乳腺發(fā)育四個特

4、殊時期的表達，研究這三種細胞標記物的分布，以探討乳腺干細胞的增殖和分化。 方法 1．乳腺組織石蠟切片的準備：6 w(體質(zhì)量180～220g)、9 w(體質(zhì)量210～230g)、孕15 d(體質(zhì)量350～380g)、產(chǎn)后3 d(體質(zhì)量330～350g)，每個時期1組，每組12只，乳腺組織塊大小為1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm，制成4μm厚切片。 2．HE染色：研究乳腺發(fā)育四個時期的形態(tài)和小亮細胞的形態(tài)分布

5、。 3．免疫組化酶標記：研究Sca-1，CD24和Muc1在乳腺發(fā)育四個時期的抗原陽性情況。 4．免疫熒光單標記：研究Sca-1，CD24，Muc1在乳腺發(fā)育四個時期的抗原陽性情況。 5．Western免疫印跡法：取6 w、9 w、孕15 d、產(chǎn)后3 d的SPF級雌性大鼠，每個時期1組，每組3只，檢測Sca-1，CD24，Muc1在乳腺發(fā)育四個時期的各自含量。 6．免疫熒光雙標記：Sea-1分別和CD24

6、以及Muc1標記，觀察它們在四個時期的雙陽性情況。 結(jié)果 1．HE染色結(jié)果6 w雌性大鼠乳腺末端主要是端芽結(jié)構(gòu)；9 w雌性大鼠乳腺主要是腺小葉。 在孕15 d乳腺組織中，乳腺的中、次級導管分支大量增加，腺泡迅速發(fā)育且數(shù)量增多。在產(chǎn)后3 d的乳腺組織中，乳腺小葉充滿分泌腺泡，腺泡上皮的形態(tài)多樣，細胞內(nèi)出現(xiàn)較多空泡，在細胞核與細胞的游離面之間的胞質(zhì)中空泡特別多，小葉內(nèi)導管明顯可見，結(jié)締組織中的血管較多，小葉間隔很薄。

7、在6 w乳腺組織中，小亮細胞大多是數(shù)個或成群地分布，常位于乳腺分支導管及末端芽的基底部；在9 w乳腺組織中，小亮細胞分布于導管及腺泡的基底膜上，也部分位于肌上皮與腺上皮細胞之間；在孕15 d乳腺組織中，小亮細胞分布于小葉導管中；在產(chǎn)后3 d乳腺組織中，小亮細胞大多分布在分支導管中。 2．免疫組化酶標記結(jié)果Sca-1<'+>細胞分別位于6 w雌性大鼠乳腺的脂肪細胞之間和腺泡周圍；9 w雌性大鼠乳腺脂肪細胞之間和腺泡周圍；孕15 d

8、雌性大鼠乳腺脂肪墊的脂肪細胞之間表達：以及產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺的脂肪細胞之間，輸乳管和乳腺脂肪墊中。 CD24<'+>細胞分別位于6 w雌性大鼠乳腺脂肪細胞之間；9 w雌性大鼠乳腺脂肪墊中；在孕15 d雌性大鼠乳腺腺泡周圍；在產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺的葉間導管。 Mucl<'+>細胞分別位于6w雌性大鼠乳腺的脂肪細胞之間，孕15 d雌性大鼠乳腺脂肪墊中；以及在產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺葉間導管。 3．免疫熒光單標記結(jié)

9、果9 w雌性大鼠葉間導管分別有Sea-1<'+>；CD24<'+>和Muc1<'+>細胞；產(chǎn)后3 d雌性大鼠母鼠乳腺分支導管分別有Sea-1<'+>；CD24<'+>和Muc1<'+>細胞。 4．Western免疫印跡法結(jié)果Sca-1在6 w和9 w乳腺中的含量沒太大變化，產(chǎn)后3 d大鼠乳腺的Sca-1含量比孕15 d的少，活動期間的2個乳腺發(fā)育時期的Sca-1含量比靜止期的含量少。CD24在大鼠乳腺發(fā)育前6 w,9 w和孕15

10、 d三個時期含量沒太大變化，而在產(chǎn)后3 d大鼠乳腺CD24含量變少。Mucl在乳腺發(fā)育活動期的2個時期含量比靜止期的2個時期高。 5．免疫免疫熒光雙標記結(jié)果6 w雌性大鼠乳腺脂肪墊；9 w雌性大鼠乳腺脂肪細胞間；孕15 d雌性大鼠乳腺脂肪細胞間；以及產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺脂肪細胞間均發(fā)現(xiàn)有Sca-1和CD24雙陽性細胞。 6 w雌性大鼠乳腺腺泡周圍和分支導管；9 w雌性大鼠乳腺腺泡周圍；孕15d雌性大鼠乳腺脂肪細胞之間以

11、及產(chǎn)后3 d雌性大鼠乳腺分支導管存在Muc1和Sca-1雙陽性細胞。 結(jié)論 1．活動期的乳腺上皮細胞在乳導管基質(zhì)中廣泛增殖，乳腺中、次級導管分支增加；腺泡迅速發(fā)育，數(shù)量增多且胞體變大。與靜止期乳腺相比，這些明顯變化應該是懷孕期間多種激素的作用結(jié)果；4個時期的生長增殖部位都出現(xiàn)小亮細胞。 2．部分Sca-1陽性細胞可能代表一類腔祖上皮細胞，而且在不同時期含量是有變化的。 3．關(guān)于乳腺干細胞的表面標志物在乳腺

12、發(fā)育過程中可能有變化：(1)標志物性質(zhì)的變化，即有不同標志物的保留或更替；(2)標志物表達量的變化。實驗結(jié)果顯示CD24在前三個時期含量沒變化，在產(chǎn)后3 d發(fā)生變化可能是對稱分裂發(fā)生的比較多，也可能是細胞橫向分化，使得這個時期干細胞含量降低。 4．Mucl在分泌乳汁的腺泡周圍和導管內(nèi)側(cè)以及脂肪等多個部位表達，Mucl在乳腺發(fā)育活動期的2個時期含量比靜止期含量高，它可能是成熟腔上皮細胞的標志。 5．在乳腺發(fā)育時期，乳腺細胞