促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素-MAPKs信號(hào)途徑在銀屑病發(fā)病中的作用.pdf

1、第一部分促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素及其受體在慢性斑塊型銀屑病皮損中表達(dá)的研究
　　 背景：
　　 銀屑病是一種常見(jiàn)的由多基因遺傳決定的、多環(huán)境因素刺激誘導(dǎo)的慢性炎癥性皮膚病，以表皮角質(zhì)形成細(xì)胞過(guò)度增殖和異常分化為主要特征。本研究擬通過(guò)免疫組織化學(xué)和蛋白印跡方法觀察慢性斑塊型銀屑病患者皮損、非皮損和正常對(duì)照皮膚組織中CRH和CRH-R1的表達(dá)情況，探討皮膚中CRH和CRH-R1在銀屑病發(fā)病機(jī)制中的作用。
　　 目的：

2、
　　 用免疫組織化學(xué)和蛋白印跡法檢測(cè)慢性斑塊型銀屑病患者皮損、非皮損和正常對(duì)照皮膚組織中CRH和CRH-R1的表達(dá)情況，初步探討皮膚中CRH和CRH-R1與銀屑病的關(guān)系。
　　 方法：
　　 1.標(biāo)本來(lái)源
　　 26例銀屑病患者均來(lái)自山東大學(xué)齊魯醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診或者住院病人，所有病例均經(jīng)臨床確診為慢性斑塊型銀屑病。
　　 2.免疫組織化學(xué)檢測(cè)
　　 取銀屑病患者皮損、非皮損以及正常對(duì)照

3、皮膚組織進(jìn)行CRH和CRH-R1免疫組織化學(xué)檢測(cè)。用Image-Pro Plus6圖像分析軟件分析圖像?？笴RH抗體，抗CRH-R1抗體。
　　 3.蛋白印跡檢測(cè)
　　 分別取銀屑病患者皮損、非皮損以及正常對(duì)照皮膚組織提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、顯影、凝膠成像系統(tǒng)成像、Quantity One成像分析軟件進(jìn)行半定量分析等步驟，檢測(cè)CRH和CRH-R1的表達(dá)?？笴RH抗體，抗CRH-R1

4、抗體。
　　 結(jié)果：
　　 1.銀屑病患者皮損、非皮損及正常對(duì)照皮膚CRH表達(dá)的檢測(cè)
　　 免疫組織化學(xué)染色分析：陽(yáng)性表達(dá)為棕色顆粒。銀屑病患者皮損、非皮損及正常對(duì)照皮膚標(biāo)本均有CRH的陽(yáng)性表達(dá)，主要集中在表皮層。
　　 蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果表明：銀屑病患者皮損、非皮損及正常對(duì)照皮膚均有CRH蛋白的表達(dá)。Quantity One成像分析軟件進(jìn)行半定量分析：銀屑病患者皮損CRH水平較非皮損和正常對(duì)照皮膚顯著降低

5、，非皮損和正常對(duì)照皮膚中的表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 2.銀屑病患者皮損、非皮損及正常對(duì)照皮膚CRH-R1表達(dá)的檢測(cè)結(jié)果
　　 免疫組織化學(xué)染色分析：陽(yáng)性表達(dá)為棕色顆粒。銀屑病患者皮損、非皮損及正常對(duì)照皮膚標(biāo)本均有CRH-R1的陽(yáng)性表達(dá)，主要集中在表皮層。
　　 蛋白印跡檢測(cè)結(jié)果表明：銀屑病患者皮損、非皮損及正常對(duì)照皮膚均有CRH-R1蛋白的表達(dá)。Quantity One成像分析軟件進(jìn)行半定量分析：銀屑病患者皮

6、損部位CRH-R1水平較非皮損部位和正常對(duì)照皮膚顯著降低，非皮損部位皮膚和正常對(duì)照皮膚CRH-R1表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論：
　　 1.免疫組織化學(xué)和蛋白印跡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)銀屑病患者皮損、非皮損及正常對(duì)照皮膚均有CRH和CRH-R1蛋白的表達(dá)；
　　 2.銀屑病患者皮損中存在CRH和CRH-R1的異常表達(dá)：CRH和CRH-R1在銀屑病患者皮損中的表達(dá)明顯低于非皮損及正常對(duì)照皮膚，CRH和CRH-R1的表達(dá)在非

7、皮損和正常對(duì)照組織中表達(dá)差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 第二部分促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素及其受體/MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)途徑對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)VEGF和IL-18的影響
　　 背景：
　　 本研究擬在體外培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞中，以主要由KC細(xì)胞分泌的VEGF和IL-18為主要指標(biāo)，觀察CRH對(duì)KC表達(dá)VEGF和IL-18的影響及其可能的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。
　　 目的：
　　 1.觀察CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞

8、表達(dá)VEGF和IL-18的影響；
　　 2.探討MAPKs信號(hào)傳導(dǎo)途徑在CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)VEGF和IL-18調(diào)控中的作用。
　　 方法：
　　 1.HaCaT細(xì)胞的培養(yǎng)
　　 永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞用含10％FBS的DMEM置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
　　 (1)根據(jù)參考文獻(xiàn)選擇100 nM CRH孵育HaCaT細(xì)胞，不同時(shí)間點(diǎn)收集

9、細(xì)胞，測(cè)定VEGF和IL-18 mRNA及蛋白的表達(dá)；
　　 (2)HaCaT細(xì)胞給予不同濃度CRH孵育，測(cè)定VEGF和IL-18 mRNA及蛋白的表達(dá)；
　　 (3)HaCaT細(xì)胞分別經(jīng)CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP6001259預(yù)處理1 h后，給予100 nM CRH孵育，測(cè)定HaCaT細(xì)胞VEGF和IL-18

10、mRNA及蛋白的表達(dá)；
　　 (4)HaCaT細(xì)胞給予100 nM CRH孵育，檢測(cè)ERK1/2、p38 MAPK和JNK1/2的磷酸化；
　　 (5)HaCaT細(xì)胞經(jīng)CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP6001259預(yù)處理1 h后，給予CRH孵育，測(cè)定ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2磷酸化改變。
　　

11、 3.實(shí)驗(yàn)方法
　　 3.1.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)VEGF和IL-18 mRNA的表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞提取總RNA，經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)得到cDNA，以管家基因β-actin作為參照，通過(guò)real-time RT-PCR技術(shù)檢測(cè)VEGF和IL-18 mRNA的表達(dá)。
　　 3.2.雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)VEGF和IL-18蛋白表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行孵育、酶反應(yīng)、顯色等步驟，酶聯(lián)

12、免疫檢測(cè)儀450nm處測(cè)量各孔吸光值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出相應(yīng)濃度。
　　 3.3.Western blot檢測(cè)ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2蛋白表達(dá)
　　 將所收集的細(xì)胞提取總蛋白，經(jīng)過(guò)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、轉(zhuǎn)膜、蛋白印跡、顯色、凝膠成像系統(tǒng)成像、Quantity One成像分析軟件進(jìn)行半定量分析，檢測(cè)ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2蛋白的表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1

13、.CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)VEGF的影響
　　 1.1.不同時(shí)間點(diǎn)100 nM CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)的影響
　　 100 nM CRH在一定范圍內(nèi)時(shí)間依賴性降低VEGF mRNA表達(dá)，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中100 nM CRH孵育4 h時(shí)VEGF mRNA表達(dá)量最低。
　　 1.2.不同濃度的CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)和VEGF蛋白分泌的影響
　　

14、 CRH濃度依賴性降低VEGF mRNA和蛋白表達(dá)，與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 1.3.CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP6001259對(duì)CRH刺激的HaCaT細(xì)胞VEGFmRNA表達(dá)和VEGF蛋白的分泌影響
　　 1.4.MAPKs信號(hào)途徑在CRH降低HaCaT細(xì)胞表達(dá)VEGF中的作用
　　 1

15、.4.1.CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 1.4.2.CRH-R1拮抗劑antalarmin、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP600125對(duì)CRH誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 2.CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞表達(dá)IL-18的影響
　　 2.1.不同時(shí)間點(diǎn)100 nM CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-18 mRNA表達(dá)

16、的影響
　　 2.2.不同濃度CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞IL-18 mRNA表達(dá)和IL-18蛋白分泌的影響
　　 2.3.CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580、JNK1/2阻斷劑SP600125對(duì)CRH刺激的HaCaT細(xì)胞IL-18mRNA表達(dá)和IL-18蛋白的分泌影響
　　 2.4.MAPKs信號(hào)途徑在CRH降低HaCaT細(xì)胞表達(dá)IL-18

17、中的作用
　　 2.4.1.CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 2.4.2.CRH-R1拮抗劑antalarmin、ERK1/2阻斷劑PD98059、p38 MAPK阻斷劑SB203580和JNK1/2阻斷劑SP600125對(duì)CRH誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2磷酸化的影響
　　 結(jié)論：
　　 1.CRH抑制HaCaT細(xì)胞V

18、EGF和IL-18 mRNA和蛋白的表達(dá)；
　　 2.CRH能夠活化HaCaT細(xì)胞ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2信號(hào)途徑，CRH-R1參與了CRH對(duì)ERK1/2、p38 MAPK、JNK1/2信號(hào)途徑的活化；
　　 3.CRH-R1和p38 MAPK、JNK1/2信號(hào)途徑參與了CRH對(duì)HaCaT細(xì)胞VEGFmRNA和蛋白表達(dá)的抑制作用；
　　 4.CRH-R1和ERK1/2、p38 MAPK、JNK