梗阻性黃疸對(duì)肝膽運(yùn)輸系統(tǒng)影響的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景和目的：
　　 梗阻性黃疸一直被認(rèn)為是外科的急癥和重癥，其發(fā)病率較高，主要病因?yàn)楦蝺?nèi)外膽管結(jié)石，腫瘤和狹窄等疾病。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，內(nèi)鏡和超聲內(nèi)鏡在解除梗阻，明確病因方面起了非常關(guān)鍵的作用。但是梗阻性黃疸造成肝臟的損害，嚴(yán)重影響肝功能。即使在有效解除梗阻后，仍需長(zhǎng)期治療才能使肝功能恢復(fù)或接近正常水平，嚴(yán)重病例可導(dǎo)致不可逆性肝損害。目前尚無系統(tǒng)的臨床和基礎(chǔ)研究觀察梗阻性黃疸對(duì)肝細(xì)胞損害的進(jìn)展過程，以及黃疸解除后肝臟逐漸恢

2、復(fù)的動(dòng)態(tài)過程，因而缺乏以梗阻性黃疸引流后肝細(xì)胞狀態(tài)為客觀依據(jù)選擇治療方法的臨床治療方案，而膽管梗阻、膽汁淤積又是常見的病理環(huán)境，也是臨床治療的難題，其相關(guān)發(fā)病機(jī)制的基礎(chǔ)研究具有現(xiàn)實(shí)意義。
　　 肝膽運(yùn)輸系統(tǒng)(Hepatobliary transport system)是一類參與膽汁成分形成、攝取和排泌的蛋白的統(tǒng)稱。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過30種，分布于肝細(xì)胞的基底膜（肝血竇面）和頂膜（毛細(xì)膽管面）、膽管上皮細(xì)胞、小腸上皮和遠(yuǎn)端腎小管，功

3、能各異。正常生理情況下，肝細(xì)胞表面存在兩類膽酸運(yùn)輸基(Biletransporter):肝基底運(yùn)輸基(Basolateral transporter)和肝小管運(yùn)輸基(Canalicular transporter)。這兩類運(yùn)輸基分別從血循環(huán)中吸收膽酸和向膽汁中泵出膽酸，從而維持膽酸在肝細(xì)胞中的平衡。在膽汁的形成與分泌過程中，肝膽運(yùn)輸系統(tǒng)扮演著活躍的角色，它不僅參與正常膽汁流的形成，而且參與了肝臟排出各種各樣的內(nèi)源性和外源性化學(xué)物質(zhì)如膽汁

4、酸、膽紅素、膽固醇、磷脂、激素藥物及各種毒性物質(zhì)，以最大限度的保護(hù)肝臟。但是在炎癥和梗阻的環(huán)境下，肝臟膽道運(yùn)輸系統(tǒng)發(fā)生失衡，運(yùn)輸基表達(dá)發(fā)生改變，肝細(xì)胞內(nèi)膽酸水平升高產(chǎn)生膽酸毒性，從而造成肝細(xì)胞損害。目前對(duì)于梗阻性黃疸情況下，肝膽運(yùn)輸系統(tǒng)的改變發(fā)生機(jī)制作用尚不十分清楚。
　　 因此，本研究通過建立大鼠膽管梗阻及再通模型，在此模型基礎(chǔ)上連續(xù)觀察梗阻性黃疸時(shí)以及解除黃疸后的病理過程，通過RT-PCR和免疫組化技術(shù)，從mRNA和蛋白等不

5、同水平上評(píng)價(jià)肝臟損害的程度，探討這一病理過程中肝膽運(yùn)輸系統(tǒng)的變化規(guī)律，初步了解其分子機(jī)制，從而為臨床上防止或減慢肝臟纖維化的進(jìn)程提供寶貴的依據(jù)。
　　 材料與方法：選取健康雄性Wistar大鼠72只，體重250-300克，隨機(jī)分成三組:分為A假手術(shù)組（Sham operation，SO組，n=24）、B梗阻性黃疸組(Obstructivejaundice，OJ組，n=24)和C梗阻后再通組(Obstruction recanal

6、ization，OR組，n=24)。A組為對(duì)照組，行假手術(shù);B組為實(shí)驗(yàn)組，行膽總管置管結(jié)扎;C組為實(shí)驗(yàn)組，行膽總管置管結(jié)扎7天后再通。分別于手術(shù)、置管結(jié)扎及再通后第1、3、7天處死動(dòng)物，留取標(biāo)本，每個(gè)預(yù)定時(shí)相點(diǎn)取8只大鼠，留取血液送化驗(yàn)室檢測(cè)肝功能;留取肝右葉應(yīng)用10％甲醛固定，留作HE染色及免疫組化;留取肝左葉-80℃凍存，留作RT-PCR檢測(cè)。
　　 1、應(yīng)用全自動(dòng)生化分析儀對(duì)大鼠血清中TBIL、ALT、TBA的含量進(jìn)行檢測(cè)

7、，分析各組大鼠肝功能的變化。
　　 2、通過HE染色觀察膽管梗阻不同時(shí)間點(diǎn)大鼠肝組織的病理學(xué)改變。
　　 3、通過RT-PCR技術(shù)，檢測(cè)NTCP、BSEP、MRP2等肝膽運(yùn)輸系統(tǒng)的mRNA分子表達(dá)情況，觀察不同時(shí)間點(diǎn)各基因的變化規(guī)律。
　　 4、通過免疫組化技術(shù)，觀察NTCP、BSEP、MRP2在不同時(shí)間點(diǎn)蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：
　　 1、動(dòng)物模型情況成功建立了大鼠膽管梗阻/再通的動(dòng)物模型

8、。SO組共造模24只，術(shù)后全部存活，至各時(shí)相點(diǎn)處死時(shí)無死亡。OJ組共造模27只，術(shù)后死亡3只，死亡率為11.1％。OR組共造模28只，術(shù)后死亡4只，死亡率為14.3％。兩實(shí)驗(yàn)組（OJ組和OR組）之間死亡率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。SO組造模全部成功。OJ組和OR組在造模過程中除出現(xiàn)動(dòng)物死亡外，還有導(dǎo)管脫出、導(dǎo)管堵塞等常見并發(fā)癥發(fā)生，但這些并發(fā)癥在兩實(shí)驗(yàn)組之間并無明顯差異，OJ組和OR組動(dòng)物模型制作的成功率分別為77.8％和75.

9、0％，相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 2、肝功能結(jié)果SO組大鼠術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)血清中TBIL、ALT、TBA含量無明顯差別(P＞0.05)。OJ組大鼠梗阻后各時(shí)相點(diǎn)血清中TBIL、ALT、TBA含量明顯升高，較之SO組各對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)具有明顯差別(P＜0.05)。OR組大鼠再通后各時(shí)相點(diǎn)血清中TBIL、ALT、TBA含量均有所下降，再通后第7天基本降至SO組水平(P＞0.05)。
　　 3、HE染色結(jié)果SO組大鼠術(shù)后各

10、時(shí)相點(diǎn)肝細(xì)胞形態(tài)正常，顯示正常肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列，均無肝細(xì)胞壞死。OJ組大鼠梗阻后第1天可見肝組織中少量嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn);第3天可見新增生的細(xì)小膽管和無管腔的小膽管，嗜中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)較術(shù)后第1天明顯增加，肝細(xì)胞輕度變性，可見少量灶狀和片狀壞死，肝組織匯管區(qū)可見膽管增生和纖維組織細(xì)胞增生，偶見膽管擴(kuò)張;第7天可見肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死的程度加重，部分肝小葉正常結(jié)構(gòu)喪失，肝細(xì)胞腫脹，排列紊亂，疏

11、松變性，核染色加深，小葉間質(zhì)炎癥，膽管上皮細(xì)胞增生明顯，可見纖維細(xì)胞增生，其管壁周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。OJ組大鼠隨著時(shí)間的進(jìn)展，肝臟損傷、纖維化程度逐漸加重。OR組大鼠再通后第1天可見肝細(xì)胞出現(xiàn)變性壞死的程度有所減輕，小葉間仍可見炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、膽管增生和纖維細(xì)胞增生;第3天可見肝細(xì)胞變性壞死的程度進(jìn)一步縮小和減輕，可見部分纖維細(xì)胞增生，其管壁周圍少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);第7天可見大鼠肝組織形態(tài)基本恢復(fù)正常。
　　 4、RT-PCR結(jié)果SO

12、組大鼠術(shù)后各時(shí)相點(diǎn)肝組織中NTCP、BSEP、MRP2的mRNA表達(dá)無明顯差別(P＞0.05)。OJ組大鼠梗阻后各時(shí)相點(diǎn)肝組織中NTCP、BSEP、MRP2的mRNA表達(dá)逐漸減弱，與SO組各對(duì)應(yīng)時(shí)相點(diǎn)比較有顯著差別(P＜0.05)，且術(shù)后第7天表達(dá)最弱。OR組大鼠再通后各時(shí)相點(diǎn)肝組織中NTCP、BSEP、MRP2的mRNA表達(dá)逐漸增強(qiáng)，再通后第7天基本恢復(fù)至SO組水平(P＞0.05)。
　　 5、免疫組化結(jié)果SO組大鼠術(shù)后各時(shí)相

13、點(diǎn)肝組織中NTCP、BSEP、MRP2在肝細(xì)胞膜上規(guī)則表達(dá)，顯露出肝細(xì)胞輪廓，無明顯差別(P＞0.05)。OJ組大鼠梗阻后第1天肝組織中NTCP、BSEP、MRP2在肝細(xì)胞膜上表達(dá)不規(guī)則，染色稀疏散亂;第3天表達(dá)更加不明顯，染色更為稀疏散亂;第7天肝組織中未見明顯表達(dá)。OJ組大鼠梗阻后各時(shí)相點(diǎn)與SO組比較均明顯下調(diào)(P＜0.05)。OR組大鼠再通后第1天肝組織中可見NTCP、BSEP、MRP2在肝細(xì)胞膜上表達(dá)，但染色稀疏散亂;第3天表達(dá)

14、增強(qiáng)，但在肝細(xì)胞膜上表達(dá)仍不規(guī)則;第7天表達(dá)基本恢復(fù)至SO組水平(P＞0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1、大鼠膽管梗阻/再通的動(dòng)物模型建立，較好地模擬了臨床上梗阻性黃疸及再通的病理生理過程，重復(fù)性及穩(wěn)定性好，手術(shù)簡(jiǎn)單易行，成功率較高。
　　 2、在大鼠膽管梗阻及再通的過程中，肝功能隨時(shí)間發(fā)生相應(yīng)改變，肝臟組織出現(xiàn)不同程度的病理表現(xiàn)，NTCP、BSEP、MRP2等肝膽運(yùn)輸系統(tǒng)在基因和蛋白水平的表達(dá)也隨不同時(shí)間點(diǎn)發(fā)