Syndecan-1、FGF2-FGFR1在上皮性卵巢癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、目的:
　　Syndecan來自希臘文Syndein，意思將細(xì)胞微環(huán)境的成分與細(xì)胞骨架結(jié)合起來。它屬于跨膜蛋白聚糖(proteoglycans，PGs)類細(xì)胞粘附分子，核心蛋白通過共價(jià)鍵連接4-7條糖氨聚糖側(cè)鏈(glycosaminoglycan，GAG)。 Syndecan家族包括4個(gè)成員:Syndecan-1(SDC-1，CD-138)，-2，-3，-4。機(jī)體不同組織表達(dá)不同的Syndecan成員，具有不同的結(jié)構(gòu)和功能。SDC

2、-1和-4表達(dá)于多種細(xì)胞，包括上皮、內(nèi)皮、血管平滑肌;SDC-2在培養(yǎng)的肺、皮膚纖維細(xì)胞中表達(dá);SDC-3表達(dá)限于中央神經(jīng)系統(tǒng)及外周神經(jīng)。
　　Syndecans介導(dǎo)細(xì)胞—細(xì)胞和細(xì)胞—間質(zhì)的粘附而影響細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)特征、細(xì)胞遷移、信號(hào)傳導(dǎo)及血凝。這些生物效應(yīng)被認(rèn)為多由HS鏈介導(dǎo)，HS可連接許多配體，例如生長(zhǎng)因子(GF)，細(xì)胞因子，細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)分子，蛋白酶，蛋白抑制劑等。通過與可溶性GF連接，syndecans作為低親合

3、力輔助受體，積聚配體并將之遞呈給高親合力受體[1]。SDC-1是syndecan家族中研究最多的成員，主要存在于上皮細(xì)胞并被廣泛研究。通過HS鏈（結(jié)合于胞外域），SDC-1與許多ECM分子相結(jié)合（膠原，纖維結(jié)合蛋白，thrombospondin，tenascin等）。胞內(nèi)域與肌動(dòng)蛋白微細(xì)纖維有關(guān)，因此，SDC-1是一種間質(zhì)固定者，將細(xì)胞結(jié)合于基質(zhì)，而且通過HS鏈，SDC-1與FGFS結(jié)合且作為FGFS的輔助受體來影響細(xì)胞行為。
　

4、　bFGF也叫FGF-2，是一種肝素結(jié)合GF的原型與syndecans連接，當(dāng)通過syndecan的HS鏈定位于細(xì)胞間質(zhì)時(shí)仍具活性[2]。bFGF與HS間的作用被認(rèn)為會(huì)導(dǎo)致bFGF的雙分子化，協(xié)助GF與FGF受體結(jié)合，從而受體雙分子化，致使胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)體系被激活[3]。bFGF是一個(gè)多功能細(xì)胞分子，而在多種細(xì)胞和組織內(nèi)發(fā)揮作用[4]，它是血管新生因素，可影響細(xì)胞遷移，在多個(gè)進(jìn)化過程中是一個(gè)細(xì)胞分化因素。本實(shí)驗(yàn)是為了探討FGF2/FGFR

5、1，SDC-1在卵巢病變中的表達(dá)（蛋白水平和mRNA水平），F(xiàn)GF2對(duì)卵巢癌細(xì)胞生長(zhǎng)的作用以及FGF2對(duì)卵巢癌細(xì)胞中SDC-1表達(dá)的影響，最終討論FGF2/FGFR1，syndecan-1在上皮性卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法:
　　一、檢測(cè)FGF-2/FGFR1在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)情況
　　應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)正常卵巢、良性卵巢瘤、卵巢交界瘤和上皮性卵巢癌原發(fā)灶以及其大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶中FGF2/FGFR1的表

6、達(dá)，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)組織中其mRNA表達(dá)水平。
　　二、檢測(cè)FGF-2對(duì)SKOV3細(xì)胞株增殖的影響
　　培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞，加入FGF2100pg/ml，F(xiàn)GF21ng/ml，F(xiàn)GF210ng/ml and10％FCS，應(yīng)用trypan blue排除實(shí)驗(yàn)來評(píng)估細(xì)胞的增殖活力;在細(xì)胞中加入FGF-2100pg/ml，1ng/ml，10ng/ml和FGF2-NA100μg/ml，應(yīng)用BrdU標(biāo)記法來評(píng)估細(xì)胞DNA合成狀況。應(yīng)

7、用SPSS13.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05則差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　三、檢測(cè)syndecan-1在上皮性卵巢癌組織中的表達(dá)情況
　　應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)正常卵巢、良性卵巢瘤、卵巢交界性囊腺瘤和上皮性卵巢癌原發(fā)灶以及其大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶中syndecan-1的表達(dá)，應(yīng)用RT-PCR檢測(cè)其在組織中mRNA表達(dá)水平。
　　四、檢測(cè)FGF-2對(duì)SKOV3細(xì)胞株中syndecan-1表達(dá)的影響
　　培養(yǎng)SK-OV-3細(xì)

8、胞應(yīng)用RT-PCR方法檢測(cè)mRNA變化，加入FGF2及其中和抗體FGF2-NA，分析FGF2對(duì)syndecan-1 mRNA表達(dá)的影響，結(jié)果應(yīng)用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1、FGF2及FGFR1表達(dá)情況:免疫組化:在原發(fā)灶:FGF2見于3例(10％)卵巢良性病變（1例巧囊，2例畸胎瘤），位于腺細(xì)胞胞漿，評(píng)分1-2;見于9例(36％)EOC(3例Ⅰ期，6例Ⅲ期)，評(píng)分2-3，位

9、于胞漿，正常卵巢及交界性卵巢囊腺瘤未見FGF2表達(dá)。卵巢良性病變和EOC兩組間FGF2的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;FGFR1見于2例(6.7％)卵巢良性病變（2例巧囊），評(píng)分1-2;見于8例(32％)EOC(2例Ⅰ期，6例Ⅲ期)，評(píng)分1-2，位于腺細(xì)胞胞漿，正常卵巢及交界性卵巢囊腺瘤未見FGFR1表達(dá)。卵巢良性病變和EOC兩組間FGFR1的表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;在大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶:FGF2見于4例EOC(stageⅢ)和1例卵巢交界性囊腺瘤，評(píng)分1-

10、2，染色部位是腺細(xì)胞的胞漿。FGFR1見于9例EOC(stageⅢ)和1例卵巢交界性囊腺瘤，評(píng)分1-2，染色部位是腺細(xì)胞的胞漿;RT-PCR:良性卵巢瘤和EOC兩組間FGF2/FGFR1的mRNA變化與免疫組化結(jié)果一致，即EOC組高表達(dá)，而且兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn):空白對(duì)照組的活細(xì)胞數(shù)是32100±3829/孔(48h)，39300±3750/孔(96h); FGF-2100pg/ml組的活細(xì)胞數(shù)是44600±5852/

11、孔(48h)，68499±4421/孔(96h);FGF-21ng/ml組的活細(xì)胞數(shù)是71500±4705/孔(48h)，97499±2923/孔(96h);FGF-210ng/ml組的活細(xì)胞數(shù)是101000±6333/孔(48h)，139000±3306/孔(96h);10％FCS組的活細(xì)胞數(shù)是141000±4222/孔(48h)，181000±4212/孔(96h)。組間活細(xì)胞數(shù)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05; DNA合成實(shí)驗(yàn):FGF

12、-2100pg/ml組的BrdU標(biāo)記值是1.6858±0.39914;FGF-21ng/ml組的BrdU標(biāo)記值是3.2538±1.0332;FGF-210ng/ml組的BrdU標(biāo)記值是4.1634±0.9850;10％FCS組的BrdU標(biāo)記值是5.46±1.3756，F(xiàn)GF2-NA100μg/ml組的BrdU標(biāo)記值是0.2782±0.1079，組間的BrdU標(biāo)記值存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，P＜0.05。
　　2、syndecan-1表達(dá)情況

13、:免疫組化:卵巢病變?cè)l(fā)灶中syndecan-1見于2例卵巢良性病變(6.7％)，（1例巧囊，1例畸胎瘤），位于腺細(xì)胞的胞膜和/或胞漿，評(píng)分1-2;見于1例卵巢交界性囊腺瘤(25％)，位于腺細(xì)胞的胞漿，評(píng)分1;見于8例(32％) EOC(stageⅢ)，其中7例染色位于腺細(xì)胞的胞膜和/或胞漿，2例染色位于間質(zhì)，評(píng)分1-2，正常卵巢組織中未見表達(dá)。卵巢良性病變和EOC兩組間SDC-1的表達(dá)存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;卵巢癌大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶中SDC-1見于

14、8例EOC（1例Ⅳ期，7例Ⅲ期），其中4例是癌巢腺上皮細(xì)胞染色(+)，7例間質(zhì)染色(+)，3例腺上皮和間質(zhì)染色(+)，腺細(xì)胞染色評(píng)分2，間質(zhì)染色評(píng)分2-3;RT-PCR:正常卵巢和交界囊腺瘤組織中SDC-1未見明確表達(dá)，良性瘤和EOC組間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，與免疫組化結(jié)果一致，即EOC組高表達(dá)，而且兩組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;細(xì)胞培養(yǎng):在10％FCS培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株SK-OV-3，syndecan1中等表達(dá)(48h)，高表達(dá)(9

15、6h)，隨著培養(yǎng)的時(shí)間呈現(xiàn)上揚(yáng)趨勢(shì)。當(dāng)細(xì)胞中加入FGF2時(shí)，SDC-1表達(dá)受抑制，而且沒有隨著時(shí)間而發(fā)生變化。當(dāng)細(xì)胞中加入FGF2-NA時(shí)，SDC-1呈中等強(qiáng)度表達(dá)，隨著時(shí)間而減弱。
　　結(jié)論:
　　(1)FGF2在上皮性卵巢癌的增殖性生長(zhǎng)中起到重要的促進(jìn)作用，且呈劑量依賴模式，機(jī)制是誘導(dǎo)細(xì)胞的DNA合成。而其中和抗體FGF2-NA的應(yīng)用可以抵消FGF2的促DNA合成效應(yīng)，抑制細(xì)胞增殖，于是FGF2為我們提供了卵巢癌生物治療

16、的新靶點(diǎn)新思路，而中和性抗體的使用也許會(huì)成為一次有意義的嘗試。
　　(2)syndecan-1作為細(xì)胞表面黏附分子，不僅協(xié)助FGF2以促進(jìn)細(xì)胞增殖和血管新生，促進(jìn)上皮性卵巢癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，而且很可能在上皮性卵巢癌的侵襲性生長(zhǎng)和病灶轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。我們首次報(bào)導(dǎo)了上皮性卵巢癌原發(fā)灶及大網(wǎng)膜轉(zhuǎn)移灶中的表達(dá)特點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)分析表明SDC-1在上皮性卵巢癌中表達(dá)升高，主要是腺細(xì)胞的胞膜和胞漿，而且與其在組織中的mRNA變化一致，故我們認(rèn)為其調(diào)節(jié)在轉(zhuǎn)

17、錄前水平。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)了原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶中SDC-1表達(dá)的差異:在原發(fā)灶主要是腺細(xì)胞表達(dá)，而轉(zhuǎn)移灶則主要是間質(zhì)表達(dá)，提示間質(zhì)中SDC-1的表達(dá)與卵巢癌的侵襲性生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移有一定關(guān)系。FGF-inducible response element（FiRE）是位于SDC-1啟動(dòng)子上游710 kb的一個(gè)長(zhǎng)約280 bp的基因片段，受到生長(zhǎng)因子作用而促進(jìn)SDC-1的表達(dá)。在成纖維細(xì)胞中受到FGF-2的作用而使SDC-1的表達(dá)增強(qiáng)，但角質(zhì)化細(xì)胞是受到