塞來(lái)昔布對(duì)大鼠角膜新生血管中COX-2、MMP-2表達(dá)的影響及作用機(jī)理初步探討.pdf

1、研究背景：
　　 角膜新生血管(corneal neovascularization,CNV)是多種眼表疾病如感染性角膜疾病、眼化學(xué)傷、熱燒傷、非感染性角膜疾病角膜變性的顯著特征之一,也是角膜移植術(shù)后發(fā)生排斥反應(yīng)的高危因素。常導(dǎo)致角膜失去正常透明性,是致盲的主要因?yàn)?。正常角膜組織內(nèi)缺乏血管和淋巴,角膜的解剖結(jié)構(gòu)特點(diǎn)在一定程度上阻止了角膜的新生血管的形成,主要依賴(lài)于抗血管生成因素的存在和角膜基質(zhì)形成的抗血管穿透性屏障。在外傷、炎癥

2、、角膜移植排斥反應(yīng)及其他因?yàn)檎T導(dǎo)時(shí),維持角膜無(wú)血管的平衡因素被打破時(shí),導(dǎo)致角膜新生血管的形成。目前研究發(fā)現(xiàn)新生血管的發(fā)生與角膜緣解剖及功能異常、炎癥反應(yīng)、缺氧、多種促血管生成因子增加、抑制血管生成因子減少、角膜水腫、角膜神經(jīng)損傷等多種因素參與多種的過(guò)程。其具體形成機(jī)制不完全清楚。
　　 目前臨床上治療各種因?yàn)閷?dǎo)致的角膜新生血管方法繁多,如血管靜止期考慮手術(shù)或者激光,活躍生長(zhǎng)期考慮藥物如糖皮質(zhì)激素治療,但效果都不理想,且長(zhǎng)期使用易

3、出現(xiàn)嚴(yán)重的副作用,包括眼壓升高、傷口愈合延遲、白內(nèi)障及其他全身副作用。近來(lái)嘗試將選擇性環(huán)氧化酶-2(COX-2)抑制劑應(yīng)用于眼部新生血管性疾病,已在大鼠模型上取得一定成果。主要應(yīng)用于糖尿病視網(wǎng)膜病變、脈絡(luò)膜新生血管、角膜新生血管等。塞來(lái)昔布(Celecoxib,選擇性Cox-2抑制劑,非甾體抗炎藥NSAID中的一種)是高度選擇性COX-2抑制劑,對(duì)COX-2的抑制強(qiáng)度比對(duì)COX-1強(qiáng)375倍。NSAID在臨床上廣泛應(yīng)用與治療類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)

4、炎、家族性腺瘤息肉、疼痛等,特別是近年對(duì)該藥物研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)除了具備一般非甾體抗炎藥的作用,還具有抗腫瘤、抗新生血管及抑制角膜移植后免疫排斥反應(yīng)的作用。
　　 環(huán)氧合酶(cyclooxygenase,COX)是前列腺素合成的限速酶,目前已知有三種異構(gòu)體,即COX-1、COX-2和COX-3,其中COX-2為“誘導(dǎo)性表達(dá)”,它在大多數(shù)正常組織中檢測(cè)不到,而在細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子、癌基因及促腫瘤劑等多種刺激下表達(dá)明顯上調(diào),參與炎

5、癥反應(yīng)、血管新生、細(xì)胞增殖及分化過(guò)程?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases MMPs)是一族Zn2+依賴(lài)性?xún)?nèi)源性蛋白水解酶家族,在降解細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix ECM)及基底膜、促新生血管發(fā)生,腫瘤侵襲與轉(zhuǎn)移等對(duì)CNV的形成有重要作用。兩種蛋白酶在促進(jìn)角膜血管新生方面起了重要作用。
　　 因此,我們的實(shí)驗(yàn)通過(guò)局部應(yīng)用選擇性環(huán)氧化酶-2抑制劑Celecoxb,觀察其對(duì)縫線誘

6、導(dǎo)的角膜新生血管的影響,HE染色觀察其對(duì)大鼠角膜病理改變的影響。并通過(guò)檢測(cè)角膜組織中COX-2、MMP-2蛋白及基因表達(dá)的變化探討其在角膜血管新生過(guò)程中可能作用機(jī)制。
　　 第一部分 celecoxib對(duì)大鼠角膜血管新生作用的初步觀察
　　 目的：
　　 研究celecoxib抑制大鼠角膜新生血管的生長(zhǎng)情況,檢測(cè)大鼠角膜新生血管中MMP-2的表達(dá)量,探討其抑制角膜新生血管的可能機(jī)制。
　　 方法
　

7、　 健康清潔級(jí)SD(Sprague-Dawley)大鼠30只,角膜縫線法制作大鼠新生血管模型,將CNV化大鼠隨機(jī)分組(A、B)兩組,A組:新生血管組對(duì)照組(12只),B組:celecoxib溶液組(12只),并以正常大鼠做對(duì)照(6只)。比較建模后第4天、7天、14天在裂隙燈顯微鏡下觀察各組角膜新生血管的生長(zhǎng)情況并計(jì)算角膜新生血管生長(zhǎng)面積;各組均于術(shù)后7天隨機(jī)取6只大鼠完整角膜,HE染色后在光鏡下觀察新生血管化角膜病理組織形態(tài),采用免疫

8、組織化學(xué)染色法檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)的表達(dá)。
　　 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)算資料用(x)±s表示,各時(shí)間點(diǎn)各自新生血管面積的比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)的方差分析；顯著性標(biāo)準(zhǔn)為a=0.05
　　 結(jié)果
　　 縫線后第4天、7天、14天,新生血管對(duì)照組CNV的面積((x)±s)分別為:(0.138±0.154)mm2、(0.663±0.139)mm2、(0.730±0.143)mm2

9、;Celecoxib治療組CNV分別是:(0.063±0.154)mm2、(0.425±0.129)mm2、(0.529±0.139)mm2；正常組未見(jiàn)新生血管。兩組之間比較統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異,Celecoxib治療組新生血管明顯低于新生血管對(duì)照組,P<0.05。兩組各時(shí)間點(diǎn)之間新生血管面積存在顯著差異,P<0.05。
　　 縫線誘導(dǎo)CNV后第7天,CNV化角膜HE染色結(jié)果觀察:A組角膜基質(zhì)層可見(jiàn)大量新生血管,管腔大,有淋巴細(xì)胞

10、及成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn),炎癥反應(yīng)較重；相比之下,B組新生血管明顯減少,炎癥反應(yīng)較輕。
　　 在正常角膜組織,MMP-2不表達(dá)或在上皮基底膜有微弱表達(dá)；新生血管對(duì)照組7天角膜全層MMP-2表達(dá)明顯增強(qiáng),陽(yáng)性反應(yīng)為胞漿內(nèi)棕黃色或棕色顆粒,其表達(dá)部位主要分布在形成的新生血管區(qū)域；Celecoxib治療組結(jié)膜下注射較新生血管對(duì)照組明顯減少,相應(yīng)在角膜基質(zhì)層形成新生血管區(qū)域的MMP-2表達(dá)較少。
　　 結(jié)論
　　 Celeco

11、xib局部應(yīng)用具有明顯的抑制角膜新生血管的作用,且減少了角膜組織中MMP-2的表達(dá),認(rèn)為其對(duì)MMP-2的抑制作用可能是Celecoxib抑制CNV的機(jī)制之一。
　　 第二部分 celecoxib對(duì)縫線誘導(dǎo)角膜新生血管中COX-2、MMP-2表達(dá)的影響
　　 目的：
　　 檢測(cè)局部應(yīng)用Celecoxib對(duì)大鼠角膜新生血管中COX-2、MMP-2表達(dá)的影響,探討Celecoxib抑制角膜新生血管的可能機(jī)制。
　

12、　 方法
　　 取33只SD大鼠,縫線法成功制作大鼠角膜新生血管模型。隨機(jī)將動(dòng)物分成celecoxib溶液組(15只,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只6眼)、新生血管對(duì)照組(15只,每個(gè)時(shí)間點(diǎn)3只6眼)、空白對(duì)照組(3只6眼)。各組于術(shù)后第1、4、7、14、21天取下帶角鞏緣的完整角膜,常規(guī)制作石蠟塊,HE染色后光鏡下觀察角膜的病理組織形態(tài)學(xué)特征,行免疫組織化學(xué)及RT-PCR檢測(cè)COX-2、MMP-2的分布及表達(dá)強(qiáng)度。
　　 采用SPS

13、S13.0統(tǒng)計(jì)軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計(jì)量資料采用(x)±S表示,COX-2mRNA、MMP-2mRNA的表達(dá)量組間采用獨(dú)立樣本t'檢驗(yàn)；各時(shí)間點(diǎn)兩種基因比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析；Pearson相關(guān)性分析進(jìn)行相關(guān)性檢驗(yàn)。以P<0.05表示統(tǒng)計(jì)學(xué)上有顯著性差異。
　　 結(jié)果
　　 縫線后個(gè)時(shí)間點(diǎn),新生血管模型中COX-2mRNA的表達(dá)分別為15.381±2.367mm2、67.176±8.845mm2、103.551±

14、4.153mm2、49.286±5.319 mm2、9.829±2.722mm2、6.465±5.540mm2；MMP-2mRNA的表達(dá)0.783±0.199mm2、2.504±0.361mm2、7.433±0.053mm2、2.286±0.111mm2、0.987±0.196mm2:Celecoxib治療組COX-2mRNA的表達(dá)為3.616±0.556 mm2、25.888±3.650mm2、44.313±6.125mm2、20.1

15、14±8.017mm2、5.186±0.806mm2；MMP-2mRNA的表達(dá)0.269±0.072mm2、1.011±0.097 mm2、2.899±300 mm2、0.739±0.065 mm2、0.079±0.005mm2；兩組間COX-2mRNA的表達(dá)有顯著性(F=125.620,P=0.000)；不同時(shí)間點(diǎn)之間有顯著差異(F=91.909,P=0.000),時(shí)間與部位之間存在顯著地交互效應(yīng)(F=14.728,P=0.000)。