KLK5在乳腺癌中的表達及其靶向microRNA的預(yù)測和驗證.pdf

1、目的：人組織激肽釋放酶基因家族(Kallikreins，KLKs)屬于絲氨酸蛋白酶家族，是近年來新發(fā)現(xiàn)的腫瘤標(biāo)志物家族，在許多惡性腫瘤中都有異常的表達。KLK5是KLKs的一個成員，人們對KLK5在乳腺癌中的表達情況的意見還存在分歧，且包括KLK5在內(nèi)的KLKs表達的調(diào)節(jié)機制尚未明確，我們通過本實驗欲達到以下三個目的：首先，探討KLK5在乳腺癌當(dāng)中的表達情況；其次，尋找與KLK53’-UTR存在靶作用關(guān)系的microRNA，探討乳腺癌中

2、KLK5表達的調(diào)節(jié)機制；第三，探討與KLK5mRNA3’-UTR存在靶作用的microRNA在乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移方面的作用。
　　 方法：⑴應(yīng)用實時熒光定量PCR(Real-time PCR)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白印跡(western-blot)對乳腺癌組織及其癌旁組織、乳腺癌細(xì)胞系MCF-7、MDA-MB-231中KLK5表達進行檢測。⑵應(yīng)用生物信息學(xué)方法，結(jié)合相關(guān)文獻報道和其在乳腺癌細(xì)胞中表達情況對與KLK

3、5mRNA3’-非翻譯區(qū)(UTR)有靶作用關(guān)系的microRNA進行初步篩選，然后應(yīng)用轉(zhuǎn)染相應(yīng)microRNA后檢測KLK5的方法和共轉(zhuǎn)染含KLK5mRNA3’-UTR的雙熒光素酶報告基因連同該microRNA后檢測相對熒光強度變化的方法對篩選出的microRNA進行靶標(biāo)驗證。⑶應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)和細(xì)胞劃痕實驗檢測與KLK53’-UTR靶作用的microRNA對乳腺癌細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。
　　 結(jié)果：①KLK5在乳腺癌組織中表

4、達低于癌旁組織，局部晚期癌中表達低于早期浸潤癌，惡性程度高的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中表達低于惡性程度低的MCF-7。②生物信息學(xué)方法篩選出十種與KLK5mRNA3’-UTR可能存在靶作用的microRNA并檢測其在MCF-7和MDA-MB-231中的表達，結(jié)果顯示只有miR-125b在MCF-7中表達低于MDA-MB-231，與KLK5在兩種細(xì)胞系中的表達情況相反；過表達miR-125b后可降低乳腺癌細(xì)胞中KLK5水平；共轉(zhuǎn)染

5、miR-125b和pmir-KLK5后可引起熒光強度的降低，但是對照組無此現(xiàn)象。③MCF-7細(xì)胞中過表達miR-125b可以使處于G1期的細(xì)胞比例增高，同時減弱細(xì)胞的劃痕修復(fù)能力。
　　 結(jié)論：⑴KLK5在乳腺癌癌組織和癌旁組織中表達存在差異且與腫瘤臨床分期及惡性程度有關(guān)，可作為判斷乳腺癌進展的生物學(xué)指標(biāo)。⑵miR-125b在MDA-MB-231中表達高于MCF-7，且經(jīng)生物信息學(xué)預(yù)測和靶標(biāo)驗證實驗證實miR-125b能夠靶作用