通過高通量篩選技術(shù)從中藥材中發(fā)現(xiàn)抗黑色素瘤的新天然化合物.pdf

1、黑色素瘤在最常見的癌癥中排第六位，它惡性程度很高，是最危險(xiǎn)的皮膚癌。黑色素瘤同時(shí)也是一個(gè)主要的健康問題，近年來它在世界范圍內(nèi)的發(fā)病率有所升高。浸潤(rùn)性黑色素瘤的發(fā)病率在白人中最高，幾乎是其他人種發(fā)病率的30倍。在65歲及65歲以上的人群中，黑色素瘤在男性中發(fā)病的可能性要比在女性中高出2倍（在女性和男性中的發(fā)病率分別為1/35和1/25），每年發(fā)病大約有100，000例。根據(jù)世界衛(wèi)生組織下屬的國(guó)際癌癥研究署的數(shù)據(jù)，皮膚黑色素瘤發(fā)病率最高的國(guó)

2、家是澳大利亞和新西蘭。黑色素瘤的發(fā)病率一直上升，但是用來治療黑色素瘤的手段有限，因此死亡率也有所上升。
　　用來阻止黑色素瘤轉(zhuǎn)移和殺死癌細(xì)胞的化療手段包括:烷基化試劑（如氮烯咪胺，有效率在15％-20％之間），鉑類藥物（如順鉑，單獨(dú)治療有效率為15％左右），微管毒素藥物（如紫杉醇，單獨(dú)使用時(shí)有效率為16％左右），這些藥物的療效不理想和藥物的副作用是化療的主要問題。從總體療效和存活率來看，當(dāng)前轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的治療手段還有待提高。雖然

3、一些藥物在生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)出了不錯(cuò)的結(jié)果，但是沒有一種藥物或者是手段能在隨后的試驗(yàn)中提高反應(yīng)的中間期和生存率。來源于植物和草藥的天然產(chǎn)物，單獨(dú)使用或者聯(lián)合其他藥物使用，也許會(huì)提供治療惡性黑色素瘤的一種新的治療方法。
　　天然產(chǎn)物一直是藥物先導(dǎo)化合物的最成功的來源，天然產(chǎn)物能提供大于標(biāo)準(zhǔn)組合化學(xué)所能提供的結(jié)構(gòu)多樣性，天然產(chǎn)物也是新型的低分子量的先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的主要來源，這些先導(dǎo)化合物具有針對(duì)多個(gè)靶點(diǎn)的活性。中藥經(jīng)過了歷史上千年的檢驗(yàn)，有

4、助于天然活性成分（尤其是用于醫(yī)療用途的活性成分）的確定，也許將推動(dòng)世界范圍內(nèi)新藥的研發(fā)。源于中藥的天然產(chǎn)物在治療癌癥中有很大潛力，例如青蒿琥酯，高三尖杉酯堿，As2O3，斑蝥素。對(duì)照臨床研究發(fā)現(xiàn)，高三尖杉酯堿和As2O3對(duì)治療白血病有顯著活性。對(duì)中藥來源的藥物的分子機(jī)制越來越多的了解及其最近在應(yīng)用方面的發(fā)展證實(shí)了:中藥和現(xiàn)代尖端科技的結(jié)合可以為發(fā)展新型和改良型抗癌藥物提供非常引人注目的策略。
　　高通量篩選是發(fā)現(xiàn)有望在不久的將來用

5、于癌癥有效治療而副作用少的天然小分子的新策略，也是加速其分離，鑒定及表征過程的新策略。在本文中，用高通量篩選的方法對(duì)源于500種中藥的組分庫的抗黑色素瘤的活性進(jìn)行了初步篩選，確定了兩個(gè)具有抗黑色素瘤和其他腫瘤活性的天然小分子。
　　使用基于高通量篩選的新策略來系統(tǒng)地針對(duì)藥物靶點(diǎn)進(jìn)行中藥活性物質(zhì)的篩選并確定。用于篩選的組分庫由中國(guó)藥典常見的500種中藥構(gòu)成，這些中藥有各種活性成分，能夠治療包括腫瘤在內(nèi)的很多疾病。為構(gòu)建中藥組分庫，每

6、種中藥粉末用95％乙醇在索氏提取器內(nèi)95℃回流提取10小時(shí)，然后用制備型高效液相色譜(HPLC)收集組分。每種中藥粗提物經(jīng)處理后，用10％-100％甲醇梯度洗脫（每個(gè)組分中可見峰在1-17個(gè)），收集80個(gè)組分，由此得到了來源于500種中藥的適合高通量篩選的40，000個(gè)組分。假定每個(gè)組分中的各種物質(zhì)的平均分子量為500道爾頓，將每個(gè)組分用DMSO溶解成20 mM溶液置于96孔板中構(gòu)成直接用于篩選的組分庫。有活性的單體化合物由進(jìn)一步的活性

7、引導(dǎo)分離得到并進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定。
　　用于篩選抗黑色素瘤中藥組分的終濃度為100μ M。用A375細(xì)胞系篩選了源于240種中藥的19，200個(gè)組分，其中67種中藥的154個(gè)組分表現(xiàn)出了抑制黑色素瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的活性。隨后進(jìn)行了陽性組分對(duì)新鮮分離的小鼠脾細(xì)胞的毒性試驗(yàn)，以排除對(duì)正常細(xì)胞有毒性的組分。結(jié)果顯示，110個(gè)組分具有顯著的細(xì)胞毒性，44個(gè)組分沒有明顯的毒性。因其抗黑色素瘤活性好而且對(duì)小鼠脾細(xì)胞毒性小，艾葉被選擇以分離其中具有抑制黑色

8、素瘤活性的化合物。有機(jī)溶劑萃取和制備型HPLC收集組分被用來分離艾葉中的活性成分。最終從艾葉中得到兩種能夠抑制A375細(xì)胞增殖的化合物，通過質(zhì)譜，1H NMR和13C NMR，確定其結(jié)構(gòu)為(O)-甲基黃酮-異澤蘭黃素（5，7-二羥基-3'，4'，6-三甲氧基黃酮）和棕矢車菊素（4，5，7-三羥基-3'，6-二甲氧基黃酮）。
　　檢驗(yàn)異澤蘭黃素對(duì)A375細(xì)胞的抑制增殖效應(yīng)的MTT測(cè)試結(jié)果表明，其EC50大約為150μM。異澤蘭黃素特

9、異性地誘導(dǎo)A375細(xì)胞形態(tài)變化，對(duì)正常的小鼠脾細(xì)胞的毒性較小。進(jìn)一步研究顯示其對(duì)A375細(xì)胞生長(zhǎng)呈現(xiàn)劑量依賴的抑制作用，與DNA損傷，細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯在G2/M期有關(guān)。異澤蘭黃素誘導(dǎo)凋亡的效應(yīng)通過Annexin V-FITC/PI雙染色并由流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)得到證實(shí)。結(jié)果顯示:150μM和300μM的異澤蘭黃素處理的細(xì)胞凋亡率分別為13.05％和29.20％，而對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率只有2.04％。同時(shí)也進(jìn)行了Hoechst33258

10、染色來檢測(cè)細(xì)胞凋亡（很容易檢測(cè)到細(xì)胞核中的DNA斷裂）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示異澤蘭黃素處理引起細(xì)胞周期阻滯，濃度為150μM和300μM的藥物處理細(xì)胞24h后，G2/M期的細(xì)胞由對(duì)照組的8.82％上升到21.70％和29.86％。
　　以上結(jié)果表明，使用中藥組分庫進(jìn)行高通量篩選的策略在發(fā)現(xiàn)抗腫瘤的天然小分子中是行之有效的方法。兩種具有抗黑色素瘤活性的黃酮類化合物值得進(jìn)一步的機(jī)制和療效研究。對(duì)本研究中發(fā)現(xiàn)的其它中藥陽性組分中單體化