Nischarin在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布及功能研究.pdf

1、背景:
　　目前針對脊髓損傷的臨床治療仍然缺乏有效手段，如何促進損傷后神經(jīng)再生，提高臨床治療效果，是神經(jīng)科學研究者的研究重點。軸突內細胞骨架是脊髓損傷后微環(huán)境中多種細胞外部信號在細胞內的整合位點，越來越多的研究均證明通過調控細胞骨架蛋白的重組可綜合細胞外部因素和內在因子的作用，顯著改善軸突再生的能力并促進功能的恢復。細胞骨架蛋白則受細胞內多種蛋白調控因子調控，因而這些能作用于軸突內細胞骨架蛋白的調控因子對脊髓損傷的修復有著舉足輕重

2、的作用。
　　Nischarin是2000年發(fā)現(xiàn)的一種分布于多種細胞胞漿的蛋白質。在過去的十年中關于Nischarin蛋白的功能研究主要集中于它對腫瘤細胞遷移能力的抑制作用上。Alahari及同事發(fā)現(xiàn)Nischarin在胞漿內可與Rho GTPase家族的重要成員Rac1、PAK結合并直接抑制它們的活性，從而減弱細胞的活動能力。隨著研究的深入，又發(fā)現(xiàn)Nischarin不僅能抑制PAK，還能直接抑制PAK下游的關鍵激酶LIMK的活性

3、，從而阻礙細胞骨架相關蛋白cofilin的磷酸化，進而影響細胞運動能力。這些研究表明，腫瘤細胞的內源性Nischarin可通過調控RhoGTPase/PAK/LIMK/cofilin信號通路，影響細胞骨架蛋白的重組。如前所述，能調控神經(jīng)元軸突內細胞骨架蛋白重組的因子對脊髓損傷修復有極其重要的意義，Nischarin若在神經(jīng)元中表達，且也能通過Rho GTPase信號通路調控軸突內細胞骨架蛋白重組，則應該有理由成為脊髓損傷治療中的一個新靶

4、標。
　　為此，本課題的主要研究目的為:探討新蛋白Nischarin在正常成年大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達與分布;研究Nischarin蛋白在脊髓損傷后軸突再生過程中的作用及其可能機制。獲得以上兩塊內容的實驗結果并加以分析，可望拓展對新蛋白Nischarin功能的研究范圍，并可能為脊髓損傷的基因或分子治療提供新的思路和靶點。
　　方法:
　　1取正常成年大鼠組織，用RT-qPCR、western blot及免疫熒光染色方法檢

5、測大鼠各主要器官和中樞神經(jīng)系統(tǒng)各部位Nischarin的表達情況。
　　2建立大鼠脊髓損傷模型，探討損傷后不同階段Nischarin蛋白在脊髓組織的表達情況;在細胞水平通過RNAi技術抑制內源性Nischarin蛋白表達，采用活細胞成像技術觀察神經(jīng)細胞突起生長的變化。
　　3采用免疫共沉淀技術研究神經(jīng)元內源性Nischarin與PAK1、LIMK1的互作情況;探討Nischarin對PAK1、LIMK1及cofilin的磷酸

6、化調控作用及其對細胞骨架蛋白F-actin的調控;活細胞成像法觀察PAK1的特異性抑制劑IPA3對Nischarin-shRNA調控神經(jīng)突起生長作用的影響。
　　結果:
　　1 Nischarin蛋白在正常成年大鼠的心、肺、肝、腎、胃、小腸、腦和脊髓組織中均有表達，在肝臟和腦組織中最為豐富;其mRNA及蛋白廣泛表達于腦的各個部位，在大腦皮層神經(jīng)元上表達量最高，海馬區(qū)神經(jīng)元其次，腦干和嗅球部位則較低，且只表達于神經(jīng)元而非膠質細

7、胞;在神經(jīng)細胞內，Nischarin的表達集中在細胞的核周及細胞突起的前緣。
　　2在正常成年大鼠脊髓組織上，Nischarin主要分布在前角運動核神經(jīng)元的核周胞漿中;與正常大鼠脊髓組織比較，Nischarin mRNA的表達從SCI后1d起顯著增高，損傷后7d達到頂峰（P＜0.01），隨后下降;與之相符，SCI后1d起Nischarin蛋白的表達即有顯著增高（P＜0.05），損傷后7d達到最高（P＜0.05），此后下降;免疫熒光

8、染色結果提示SCI后3d，脊髓組織結構紊亂，除神經(jīng)元有Nischarin表達外，膠質細胞上也一定量的表達;損傷后7d，損傷區(qū)Nischarin高度表達，大量膠質細胞增生;用aggrecan、CSPGs或TNF-α三種脊髓損傷局部產(chǎn)物處理Neuro-2a細胞，孵育2h后對Nischarin的表達影響不大（P＞0.05），孵育24 h和48 h后三者均顯著促進Nischarin的表達（P＜0.05）。
　　3①用Nis-siRNA轉染

9、Neuro-2a細胞能有效抑制內源性Nischarin的表達，抑制率達到86％（P＜0.01），Neuro-2a細胞的神經(jīng)突起形態(tài)發(fā)生明顯變化，有突起細胞百分比較control-siRNA組細胞增加3.3倍（P＜0.001），最長突起平均值增長5.4倍（P＜0.001），而平均細胞突起數(shù)目增加了1.57倍（P＜0.01）;②將4條Nis-shRNA克隆到慢病毒質粒載體，用脂質體轉染Neuro-2a細胞評價其對Nischarin的內源性表

10、達的抑制效果，實時定量PCR結果顯示Neuro-2a細胞上的轉染效率達到80％以上，與未處理細胞和對照shRNA比較，4個Nis-shRNA質粒均能有效抑制Nischarin的表達，其中Nis-shRNA-3的抑制效率到達60％(P＜0.05)，Western Blotting實驗結果與RT-qPCR實驗結果相符，4個Nis-shRNA質粒中以3號質粒的抑制效果為最佳，抑制率為81.3％（P＜0.01）;③用慢病毒包裝體系對3號質粒及其

11、scramble對照質粒進行包裝，收獲病毒液，感染PC-12細胞和原代培養(yǎng)神經(jīng)元，熒光顯微鏡下發(fā)現(xiàn)抑制內源性Nischarin表達顯著促進PC-12細胞神經(jīng)突起的生長，細胞最長神經(jīng)突起的平均值增加140％（P＜0.01），每個細胞的平均突起數(shù)目增加56％（P＜0.05），神經(jīng)突起生長速度明顯增快;抑制內源性Nischarin表達也促進原代培養(yǎng)大腦皮層神經(jīng)元突起的生長，細胞最長神經(jīng)突起的平均值增加51％（P＜0.05），但對神經(jīng)元的平均突

12、起數(shù)目影響不顯著（P＞0.05）;④膠質瘢痕抑制物aggrecan或CSPGs使Neuro-2a細胞的最長神經(jīng)突起平均值和突起數(shù)目均顯著下降，而當內源性Nischarin被抑制后，不僅使得PDL基質上的神經(jīng)細胞的突起生長加速，而且還促使細胞克服CSPGs或aggrecan對神經(jīng)生長的抑制作用(P＜0.05)。
　　4①免疫共沉淀結果顯示，神經(jīng)元內源性Nischarin可以與PAK1、LIMK1結合;②用Nischarin-shRN

13、A轉染Neuro-2a細胞使其內源性Nischarin表達量降低75％（P＜0.01），于此同時，p-PAK1/PAK1比值、p-LIMK1/LIMK1比值及p-cofilin/cofilin比值分別增加了41.5％（P＜0.05）、40％（P＜0.05）及57.5％(P＜0.01);而在SCI大鼠模型上， Nischarin的表達先增高再下降，在損傷后一周達到峰值，比sham組增高196％（P＜0.01），而p-PAK1/PAK1、p

14、-LIMK1/LIMK1及p-cofilin/cofilin比值均呈現(xiàn)先降低再增高的趨勢，并且均在損傷后一周達到最低值，分別比sham組下降了40.2％（P＜0.05）、56.3％（P＜0.01）及61.8％(P＜0.01);③免疫熒光染色結果顯示，在感染Nischarin-shRNA病毒的EGFP陽性神經(jīng)元上，神經(jīng)突起生長錐處F-actin的含量顯著增高;④抑制內源性Nischarin的表達可促使抑制性環(huán)境下神經(jīng)細胞的突起生長，但這種

15、促進作用在加入PAK1的抑制劑IPA3之后被完全逆轉（P＜0.05）。
　　結論:
　　1 Nischarin在正常成年大鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)呈區(qū)域化分布，主要表達于神經(jīng)元胞漿核周部位及神經(jīng)突起前緣。
　　2脊髓損傷可引起Nischarin的表達時間依賴性增高，其表達上調可能與脊髓損傷局部高濃度的TNF-α、抑制性物質CSPGs和aggrecan有關。
　　3用RNAi技術抑制神經(jīng)細胞內源性Nischarin的表達后