回輸不同極化類型的巨噬細胞對小鼠肝纖維化的治療作用和機制的研究.pdf

1、【背景】
　　肝纖維化由各種持續(xù)的慢性肝損傷導致,其漸進性發(fā)展最終可形成肝硬化,甚至誘發(fā)肝癌,嚴重危害人們的生命健康。針對晚期肝硬化的有效治療手段十分有限,但有效的治療可以逆轉肝纖維化,甚至恢復肝臟正常的結構和功能。因此,探索治療肝纖維化的有效方法具有重要意義。目前,針對肝纖維化的細胞治療具有廣闊的臨床應用前景。
　　肝纖維化是肝內膠原纖維異常沉積的過程,是肝損傷后的傷口愈合反應。各種慢性肝臟疾病,導致肝細胞變性、壞死和凋亡

2、,招募多種炎癥細胞浸潤。在肝內多種細胞的相互作用下,肝星形細胞活化,其合成和分泌大量細胞外基質,基質生成和降解失衡、大量沉積,導致肝纖維化。而在此過程中,巨噬細胞發(fā)揮著重要的調控作用。
　　巨噬細胞是機體重要的固有免疫細胞。在肝纖維化的發(fā)展過程中,巨噬細胞起著雙刃劍的作用。一方面,活化的巨噬細胞分泌大量細胞因子,導致肝星形細胞激活并合成分泌大量膠原蛋白;另一方面,巨噬細胞分泌基質金屬蛋白酶類,降解膠原纖維,誘發(fā)肝星形細胞凋亡,促進

3、肝纖維化的消融緩解。提示纖維化過程中,巨噬細胞的功能復雜多樣,具有一定的異質性。大量研究表明,活化的巨噬細胞可分為經(jīng)典激活的M1型巨噬細胞和替代激活的M2型巨噬細胞。二者對肝纖維化的作用不同,分別具有抗纖維化和促進纖維化的作用。目前的研究表明,骨髓來源的巨噬細胞回輸對肝纖維化具有一定的緩解作用,但關于不同極化類型巨噬細胞對肝纖維化的治療研究尚未見報道。因此,本課題擬培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細胞,用不同因子刺激誘導成為不同極化類型,將其回輸給肝

4、纖維化模型小鼠,觀察其對肝纖維化的作用,并探討其機制。
　　【目的】
　　1.研究不同極化類型的巨噬細胞回輸對小鼠肝纖維化的影響。
　　2.研究不同極化類型的巨噬細胞回輸參與肝纖維化治療的機制。
　　【方法】
　　1.CCl4腹腔注射建立小鼠肝纖維化模型。
　　2.建立巨噬細胞分離培養(yǎng)和極化誘導的方法。
　　3.用PEI-SPIO/Cy3-RNA復合物標記巨噬細胞,追蹤巨噬細胞回輸后在肝臟中的定

5、位。
　　4.回輸不同極化類型的巨噬細胞,用天狼星紅染色、肝臟羥脯氨酸測定、Desmin免疫組化染色和血清白蛋白檢測等方法評價細胞回輸后肝纖維化程度的變化和治療效果。
　　5.實時定量 PCR、流式細胞術及明膠酶譜法檢測不同極化類型的巨噬細胞中基質金屬蛋白酶和巨噬細胞趨化因子配體的表達水平。
　　6.不同極化類型巨噬細胞回輸后,用實時定量 PCR檢測肝臟組織中巨噬細胞趨化因子配體和基質金屬蛋白酶的表達、用免疫組化檢測肝

6、臟組織中 F4/80+巨噬細胞的浸潤數(shù)量、測定尿液中羥脯氨酸的含量。
　　【結果】
　　1.成功建立小鼠肝纖維化模型;成功獲得骨髓來源的巨噬細胞,并在不同誘導條件下得到M1和M2型巨噬細胞;尾靜脈回輸巨噬細胞可定位于肝纖維化區(qū)域。
　　2.天狼星紅染色、肝臟羥脯氨酸測定、Desmin免疫組化染色和血清白蛋白水平顯示,M0和M1型巨噬細胞回輸組小鼠肝臟膠原纖維沉積減少,其中M1型巨噬細胞回輸組減少更明顯,小鼠肝功能更好。

7、提示M1型巨噬細胞回輸對肝纖維化有更好的治療效果。
　　3.M1型巨噬細胞高表達MMP-2、9、13和CCL2、CCL3。
　　4.M1型細胞回輸組小鼠肝臟組織中高表達CCL2、CCL3和MMP-2、9、13,F4/80+巨噬細胞浸潤增多,尿液中羥脯氨酸含量最高。
　　【結論】
　　1.M1和M0型巨噬細胞均可緩解小鼠肝纖維化,尤以回輸M1型細胞療效更為顯著。
　　2.M1型巨噬細胞本身高表達的MMPs分子